人腰椎黄韧带Ⅰ和Ⅱ型胶原基因表达随增龄发生软骨骨化的验证特异性与客观性

目的运用特异性探针观察不同年龄组黄韧带Ⅰ和Ⅱ型胶原基因表达分布、强度及随增龄而发生的变化,采用客观图像分析验证黄韧带退行性变和骨化增龄性变假说.方法实验于2003-08/2004-08在第二军医大学长征医院中心实验室完成.21块腰椎黄韧带标本取自椎间盘突出症和椎管狭窄行后路椎板减压术患者,对照组标本取自4例青少年腰椎骨折行后路椎板减压术患者.提供标本患者均知情同意.椎间盘突出症和椎管狭窄患者的腰椎黄韧带标本按年龄分为4组＜20岁组、20～40岁组、41～60岁组和＞60岁组.用Ⅰ和Ⅱ胶原cDNA探针,对不同年龄组的黄韧带冰冻切片进行原位杂交和图像分析,观察其Ⅰ型胶原表达(成纤维细胞基因表型)和Ⅱ型胶原表达(软骨细胞基因表型).结果①原位杂交组织切片观察＜20岁组黄韧带附着点处和体部纤维细胞排列规则,细胞呈梭形细胞数目较多,有明显的Ⅰ胶原表达,无Ⅱ型胶原表达信号;20～40岁组黄韧带细胞排列尚规则,细胞的数量相对减少,出现轻度纤维化,在黄韧带的附着点处有少量的Ⅰ和Ⅱ型胶原阳性表达信号;41～60岁组黄韧带体部细胞排列不规则,细胞的数量相对减少,出现明显纤维化,黄韧带体部无明显的阳性表达,黄韧带的附着点处有较弱的的Ⅰ型胶原阳性表达,阳性表达细胞分布不均匀,但Ⅱ型胶原的表达较41岁以下组表达增强;＞60岁组黄韧带出现纤维化,未见Ⅰ型胶原阳性表达信号,黄韧带的附着点处Ⅱ型胶原阳性表达信号增强.②Ⅰ型胶原基因表达＜20岁组、20～40岁组、41～60岁组和＞60岁组均显著高于对照组(1.53±0.18,1.34±0.16,0.86±0.13,0.71±0.21,0.51±0.11,P＜0.01),随年龄增长表达逐渐减弱(P＜0.05),但41～60岁组和＞60岁组无显著差异(P＞0.05).Ⅱ型胶原基因表达＜20岁组、20～40岁组、41～60岁组和＞60岁组均显著高于对照组(0.73±0.16,1.14±0.14,1.46±0.13,1.65±0.16,0.53±0.12,P＜0.01),随年龄增长表达逐渐增强(P＜0.05).结论Ⅰ和Ⅱ型胶原cDNA探针具有高度的特异性,随着年龄的增长,ⅠⅠ型胶原表达逐渐减弱,在附着点处出现Ⅱ型胶原的表达增强,提示成纤维细胞基因表达逐渐减弱,而软骨细胞的基因表达逐渐活跃,为黄韧带退行性变和骨化提供了分子生物学依据.

Gene expression of type Ⅰ and type Ⅱ collagen in human lumbar ligamentum flavum along with age verifying cartilaginous ossification specifically and objectively