转录抑制因子Bmi-1基因正、反义真核表达载体的构建及鉴定

目的]克隆转录抑制因子Bmi-1基因并构建其正、反义真核表达载体，为研究其功能及其作用机制奠定基础。方法]根据Bmi-1基因已知序列，设计合成一对引物，上下游引物分别加入XhoI和ClaI的酶切位点，用反转录PCR（RT-PCR）方法从人红白血病细胞株（K562）总RNA中扩增编码Bmi-1的基因片段（1017 bp），插入克隆载体pMD18-T，构建pMD18-Bmi-1载体，经限制性核酸内切酶谱证实后，再克隆至逆转录病毒载体pLNCX2中，构建pLNCX2-Bmi-1真核表达载体，并经测序证实。然后以pLNCX2-Bmi-1为模板，物扩增Bmi-1基因起始密码子及编码锌指结构区域上下171bp长度的核苷酸片段，并反向连接于表达载体（pLNCX2）上。结果]DNA测序表明编码序列与读框完全正确，RT-PCR扩增出和目的片段相同的片段，正义DNA片断长度为1029bp，反义片断长度为171bp，Bmi-1基因被成功扩增并被克隆至真核表达载体pMD18-T和pLNCX2中。结论]Bmi-1正义及反义片断被成功扩增，并成功构建了Bmi-1正、反义重组真核表达载体，为进一步研究该基因打下了基础。