| 摘 要： | 目的探讨分离及培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的最佳条件。方法选取不同周龄(2、3、4、8 w)的SD大鼠;采用全骨髓贴壁筛选法对不同的培养基(L-DMEM、DMEM/F12),血清体积分数(7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%),首次换液时间(48、72、96 h),换液方法(全换液、半换液)分组进行培养,每日于倒置显微镜下观察细胞形态、数目的变化,细胞融合80%~90%时进行消化计数,记录达到传代要求的时间,取第三代细胞绘制BMSCs生长曲线,各组间免疫荧光检测CD34、CD44的表达率。结果 1第2~3周SD大鼠达到传代要求时BMSCs数目最多、所需时间最短,第8周BMSCs含量明显减少,难以形成集落生长,细胞融合不到50%;DMEM/F12培养基中的细胞贴壁早、活性强,L-DMEM培养基中的细胞生长缓慢,两组相比差异显著(P<0.05);72 h全换液和48 h半换液组细胞数目多,二者相比无统计学意义(P>0.05),24 h全换液细胞数目少,72h半换液杂细胞多,细胞呈全分布,二者增值速度慢,与前者相比差异显著(P<0.05);体积分数越高细胞生长分化越快,时间越短,但各组间比较无统计学意义(P>0.05),传代培养中高体积分数的细胞易老化。2接种圆形BMSC培养6 h后贴壁,分化成圆形、类圆形或多角形;72 h后有少量短梭形、星形细胞分散、贴壁生长,部分细胞伸出一支或多支伪足,类似于成纤维细胞;约6 d后BMSCs细胞集落呈放射状排列,伸出长短及粗细均不规则,伴形态各异的伪足、细胞胞核大、核仁清晰;约10 d细胞能融合80%~90%培养面;传代后24 h内可见细胞已完全贴壁,3 d可见以梭形为主的细胞铺满80%~90%培养面;经过1~2次传代后,细胞呈放射状或平行排列,形态趋于一致。3传代2 d后,细胞缓慢生长,处于生长停滞期;3 d起细胞转入对数生长期,4~5 d至高峰后转入平台期,细胞倍增时间约39.5 h。4传代BMSc存在CD44抗原表达,阳性率98.3%,而CD34呈阴性表达。结论全骨髓贴壁筛选法是一种获得高纯度BMSCs简单、有效的方法;在适宜的培养条件下(SD大鼠育龄为2~3 w,接种密度80%~90%培养面,培养基为DMEM/F12,合适血清体积分数为10%,72 h首次全换液)BMSCs在体外生长状态良好,增殖速度快,DAPI可作为标记BMSCs的一种有效手段,也可作为细胞免疫组化的基础染色。
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