钠泵抑制物噬菌体单链抗体库的构建

目的　应用噬菌体展示技术构建钠泵抑制物单链抗体库 .方法　用 OUA- OVA(ouabain- ovalbumin)免疫小鼠 ,取脾脏 ,分离淋巴细胞 ,提取 m RNA,逆转录成 c DNA第一链 ,用简并引物经 PCR分别扩增轻、重链抗体库 ,经重叠延伸PCR由 L inker将轻、重链拼接成 Sc Fv(单链抗体 ) ,用 RS引物以 Sc Fv为模板进行第 2次 PCR,同时在 5 及 3 端分别加上 Sfi I,N ot I酶切位点 .经 Sfi I,N ot I酶切后 ,在 T4连接酶的作用下将 Sc Fv与 p CANTAB 5 E噬菌粒连接 ,电转化进入TG1大肠杆菌 ,挑取 12个单菌落提取质粒用 Eco R 和 H ind 进行酶切鉴定 ,后经 M13KO7辅助噬菌体拯救 ,离心收集上清即为全套 Sc Fv基因的噬菌体表面展示文库 .结果　以OU A- OVA免疫小鼠 ,检测血清中抗体效价可达 (1∶ 2×10 6 ) ,用通用引物分别扩增出轻、重链片段的大小为 32 5 bp和 34 0 bp,将两者拼接得到约 72 0 bp大小的单链抗体库 ,以8× 10 1 1 的转化效率转染 TG1细胞 ,Eco R 和 H ind 酶切后 ,12个单菌落所提噬菌粒 DNA中有 10个切出了约为 2 .1kb的目的条带 ,所构建的噬菌体抗体库库容量约为 1.2× 10 8.经 M13KO7超感染后 ,测噬斑滴度为 9× 10 1 4 pfu· L- 1 .结论　成功地构建了钠泵抑制物噬菌体单链抗体库 .

Construction of ouabain single-chain Fv phage antibody library by phage display