| 摘 要： | 【立论依据】 I型糖尿病又称自身免疫性糖尿病,是由于自身免疫耐受机制打破、自身反应性T细胞攻击胰岛β细胞所致的自身免疫性疾病。迄今对自身免疫病的治疗方案多不理想,目前常规采用的免疫抑制手段不但降低患者免疫力,也使疾病容易复发。理想的治疗自身免疫病的策略是特异性清除自身反应性T细胞,重建对自身组织抗原的免疫耐受。而自身免疫调节因子(AIRE)恰在胸腺阴性选择中具有调控组织限制性抗原(TRAs)表达、促进自身反应T细胞的清除、参与免疫耐受诱导的功能。因此,我们设想利用基因转导手段操纵骨髓细胞中AIRE的表达,通过模拟胸腺的阴性选择,诱导免疫耐受,为I型糖尿病的防治提供新策略。 【设计思路】 本实验拟通过以自身免疫糖尿病小鼠(NOD鼠)为模型,移植表达AIRE的骨髓细胞,使其在NOD鼠体内通过调控TRAs的表达清除自身反应性T细胞,观察其诱导特异性清除对胰腺组织特异性T细胞的作用及对NOD鼠糖尿病发生的影响,探索I型糖尿病防治新方法。 【实验内容】 (1)构建编码小鼠AIRE的逆转录病毒载体,将其转导入骨髓DCs细胞。(2)将转导AIRE的骨髓DCs细胞移植至经放射线照射的NOD小鼠,获得NOD嵌合鼠。(3)采用流式细胞术检测NOD嵌合鼠胸腺和脾脏中GFP+细胞数量,检测NOD鼠嵌合程度。(4)采用real-time PCR法、流式细胞术检测Ins2 mRNA水平和蛋白水平表达变化,检测AIRE对TRAs的调控作用。(5)检测NOD鼠糖尿病发生时间和程度以及其病理学和胰岛素自身抗体的改变。 【材料】 NOD鼠、编码AIRE的逆转录病毒载体、real-time PCR仪、流式细胞仪、葡萄糖检测试剂盒、尿糖试纸、ELISA试剂盒等。 【可行性】 前期工作中,以胸腺阴性选择为理论依据,对AIRE的表达、分布及其在自身耐受中的作用进行了系统、深入的研究,现以基因转导和骨髓细胞移植为技术手段,切实可行。 【创新性】 本研究首次将基因操纵和骨髓细胞移植两大先进技术相结合,利用AIRE能特异性清除自身反应性T细胞的功能,探究治疗I型糖尿病的方法,为自身免疫疾病的防治提供新思路。
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