日本血吸虫内皮分化相关因子-1基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆、表达日本血吸虫内皮分化相关因子(endothelial differentiation-related factor)-1编码基因(SjEDF-1),并研究该基因在日本血吸虫不同发育阶段的特异性表达情况。方法制备日本血吸虫卵、尾蚴、童虫和成虫等各发育阶段的总RNA,采用RT-PCR方法 ,以管家基因SjActin为内参,根据SjEDF-1基因全长编码序列(GenBank登录号为AY336498)的开放阅读框设计引物进行RT-PCR扩增,分析日本血吸虫各发育阶段SjEDF-1基因mRNA表达情况。将SjEDF-1基因亚克隆至载体pET28a,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物,以纯化的重组SjEDF-1蛋白免疫新西兰白兔制备免疫兔血清。蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫原性及该蛋白在日本血吸虫各发育阶段的表达差异。结果 RT-PCR结果显示,除尾蚴外,在虫卵、童虫、雄虫和雌虫期均扩增出约405bp的片段。含重组质粒SjEDF-1/pET-28a的转化子细菌,经IPTG诱导,获得以不可溶的包涵体形式存在的重组蛋白,其相对分子质量(Mr)为20000,与预测的融合蛋白大小相符。Western blotting分析结果显示,纯化后的重组蛋白SjEDF-1可被日本血吸虫感染兔血清识别,在血吸虫童虫和成虫阶段检测到目的蛋白的表达。结论重组蛋白SjEDF-1具有较强的免疫原性,在血吸虫童虫和成虫期检测到该蛋白特异表达。