DNA复制起始的复制压力诱导子代细胞非对称分布的染色体损伤

【立论依据】 细胞对染色体在有丝分裂后子代中分布的精密调控是生物遗传过程中最基本的特征之一。迄今对染色体在有丝分裂过程中的编程机制尚不清楚。本研究着力于研究DNA复制起始位点的复制压力所诱导的DNA损伤在子代细胞中的分布信息。 【设计思路】 通过对细胞周期的同步化处理,在DNA复制起始位点诱导复制压力,再免疫荧光染色观察染色体损伤在下一个细胞周期子细胞中的分布。从DNA损伤的角度探讨染色体分布的可能调控机制和生理意义。 【实验内容】 (1)用去血清方法将大部分细胞同步于细胞周期的G₁期,通过流式细胞术进行鉴定;(2)在细胞进入G₁期后给予血清培养,使细胞同步化开始DNA复制,实验组给予APH(DNA聚合酶抑制剂)干预,对照组给予不含APH的血清。同时加入脱氧核苷酸异构物EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)参与合成中的DNA,并可作为后续荧光标记DNA复制的起始位置;(3)流式细胞术观察细胞周期进入有丝分裂M期和到达下一个细胞周期G₁期所需的时间;(4)分别进行细胞爬片和滴片固定收样,并标染EdU(DNA复制起始位置)和FANCD2(DNA损伤修复蛋白)。观察各对子细胞中的DNA损伤情况,并进行统计分析。观察统计染色体的断裂频率,判断断裂位点与EdU染色位点的相对位置关系。 【材料】 人HBE上皮细胞;FANCD2抗体(美国Gibco公司);APH;EdU;1640培养基(美国Gibco公司)。 【可行性】 已完成的前期实验:(1)明确了DNA复制起始位点通过抑制DNA聚合酶更容易导致染色体损伤;(2)这些DNA起始位点的损伤在有丝分裂后的两个子代细胞中呈现明显的非随机、非对称分布,表现为一个子代细胞损伤明显增多,而另一个子细胞基本没有或很少出现损伤。这些前期实验结果与预期结果相符。 【创新性】 (1)首次在体细胞水平探讨DNA复制起始位点的复制压力所诱导的DNA损伤在子代细胞中的分布信息;(2)探讨DNA复制起始位点在复制压力下与染色体断裂的关系;(3)首次从DNA损伤的角度阐释染色体分布的可能调控机制。