SHP2/Hook1通过上皮间质转化调控肺肿瘤转移的机制研究

【立论依据】 肿瘤转移是肿瘤患者死亡的最主要原因,而上皮间质转化在肿瘤转移的起始过程中发挥重要作用。原癌基因ptpn11表达的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2在多种肿瘤中存在突变或高表达现象,提示SHP2参与肿瘤的发生与进展。本项目的前期研究发现SHP2促进上皮间质转化过程,且需要其酶活性的参与;新发现的SHP2相互作用蛋白Hook1在上皮间质转化中具有相反的抑制作用,而Hook1与SHP2的催化结构域结合。 【设计思路】 本项目对Hook1是SHP2的内源酶抑制剂这一假设进行研究,并探究SHP2与Hook1形成的蛋白复合物通过调节上皮间质转化过程影响肺肿瘤转移的可能性。 【实验内容】 (1)原核表达与纯化带有His标签的SHP2和Hook1蛋白,通过测定SHP2蛋白磷酸酶的活性探讨Hook1能否抑制SHP2的酶活性;(2)定量PCR、蛋白质印迹方法比较侵袭能力不同的肺上皮细胞中SHP2和Hook1在mRNA与蛋白水平上的差异;(3)miRNA干扰或过表达方法改变两种蛋白的表达水平,观察其对肿瘤细胞的迁移及侵袭能力的影响;(4)构建破坏SHP2与Hook1相互作用的截短或点突变质粒,探究Hook1对上皮间质转化以及细胞侵袭的影响是否需要SHP2的参与;(5)体内实验验证改变SHP2或Hook1的表达是否影响肿瘤细胞在小鼠体内的成瘤能力。 【材料】 原核表达质粒PET21a,His亲和纯化树脂,非小细胞性肺癌细胞株A549,SHP2siRNA,pCDNA3.1-SHP2及突变体表达载体,Hook1siRNA,pCDNA3.1-Hook1及突变体表达载体,抗SHP2、Hook1抗体,4组(每组9只,共36只)NOD/SCID小鼠。 【可行性】 前期研究发现SHP2的蛋白酪氨酸磷酸酶活性能够促进肺上皮细胞的上皮间质转化过程;SHP2的催化结构域相互作用蛋白Hook1则抑制上皮间质转化过程。在此基础上我们推测SHP2和Hook1通过上皮间质转化从而对肿瘤的转移产生影响,并且Hook1的作用需要SHP2的参与。故本研究具有较强的可行性。 【创新性】 新发现的与SHP2催化结构域相互作用的Hook1有可能成为首个SHP2的内源抑制蛋白。明确SHP2/Hook1复合物在上皮间质转化以及肿瘤转移中的作用,有助于认识SHP2与肿瘤转移的关系,所揭示的分子机制有望为肿瘤转移的早期诊断及临床治疗提供新的潜在靶点。