Mmp-2重组真核表达载体的构建及MMP-2蛋白对肝癌细胞的作用机制探讨

目的：构建人基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）基因重组真核表达载体，探讨MMP-2蛋白对肝癌细胞迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法：以肝癌SMMC-7721细胞为研究模型，以基因重组技术构建pEYFP-Mmp-2重组真核表达载体，pEYFP-Mmp-2一过性转染模型细胞过表达MMP-2-YFP，siRNA转染沉默模型细胞内源性MMP-2表达，设立空白对照、MMP-2沉默对照组、MMP-2沉默组、过表达MMP-2融合蛋白对照组、过表达MMP-2融合蛋白组，划痕实验检测细胞迁移能力，侵袭小室实验检测细胞侵袭能力，钙蛋白酶（calcium-activated neutral protease，Calpain）特异性抑制剂Calpeptin抑制Calpain活性，蛋白印记实验检测MMP-2、MMP-2-YFP、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vi－mentin）表达变化。结果：成功构建人Mmp-2重组真核表达载体pEYFP-Mmp-2。pEYFP-Mmp-2转染过表达MMP-2融合蛋白组细胞高表达MMP-2-YFP。与MMP-2沉默对照组相比，MMP-2沉默组内源性MMP-2表达明显下调（P=0.000），细胞12 h、24 h及48 h迁移率明显降低（P=0.000或P=0.001），48 h侵袭率明显降低（P=0.004），E-cadherin表达明显上调，N-cadherin及Vimentin表达明显下调（P=0.000）。与过表达MMP-2融合蛋白对照组相比，过表达MMP-2融合蛋白组12 h、24 h及48 h迁移率明显增强（P=0.015或P=0.001），48 h侵袭率明显升高（P=0.011），细胞E-cadherin表达明显下调，N-cadherin及Vimentin表达明显上调（P=0.003或P=0.001）。Calpeptin预处理明显降低过表达MMP-2融合蛋白组细胞迁移率和侵袭率（P=0.000），上调E-cadherin，下调N-cadherin及Vimentin蛋白表达水平（P=0.000）。结论：本实验通过基因重组技术成功构建人Mmp-2重组真核表达载体pEYFP-Mmp-2，成功表达MMP-2-YFP 融合蛋白；并发现MMP-2通过调节Calpain介导肝癌SMMC-7721细胞迁移、侵袭及EMT。

Construction of Mmp-2 recombinant eukaryotic expression vector and study of the mechanism of action of MMP-2 on hepatocellular carcinoma cells