SV40LTag基因诱导永生化大鼠肝星状细胞系的建立及鉴定

目的： 建立长期传代、形态和生物学特性稳定的永生化HSC。方法： 采用Pronase E、Ⅳ型胶原酶原位灌流消化及Nycodenz密度梯度离心分离大鼠原代肝星状细胞（HSC）,并进行免疫组化SABC法鉴定和培养。用Effectene Transfection Reagent方法将携带SV40LTag基因的质粒PSV3neo（该质粒由意大利学者Giovanni Gaudino PhD惠赠）转染第1代HSC，以G418筛选直至获得阳性克隆细胞，经体外长期培养和传代后，以PCR方法检测其SV40LT抗原mRNA的表达，观察细胞形态学，绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖能力，用免疫组化SABC法对α-SMA、SV40LTag、Ⅰ、Ⅲ型胶原（collagenⅠ、collagenⅢ）、desmin、转化生长因子-β₁（TGF-β₁）、血小板衍生的生长因子受体β型（PDGFRβ）进行免疫细胞化学检测，用β-actin做半定量RT-PCR检测I型胶原的表达，对其生物学特性进行研究。结果： 本研究通过使用质粒 PSV3neo转染正常大鼠HSC，经20 d抗性筛选，获得G418阳性克隆细胞，长期传代后细胞形态和结构保持完好，SV40LTag mRNA的表达检测和免疫组化染色结果阳性，经扩大筛选培养，该HSC细胞系目前已传了50代,保持着星形外观的HSC形态学特征，生长曲线显示转染阳性细胞倍增速度快，MTT法测定570 nm波长下A值显著高于对照组（P<0.01）。半定量RT-PCR法检测collagenⅠmRNA的表达明显高于对照组（P<0.01）。免疫组化染色显示能表达α-SMA、 collagenⅠ、collagenⅢ、desmin、TGF-β₁、PDGFRβ。结论： 利用SV40LTag基因序列诱导建立了永生化大鼠HSC系，新建HSC系在体外可长期传代，倍增速度快，其形态和生物学特性与原代HSC形态相似。

Establishment of immortalized rat HSC induced by the genes of Simian Virus 40 large T antigen and study on the morphological and biological characteristics of the new HSC line