测定人红细胞嘧啶5′核苷酸酶含量的双抗体夹心ELISA方法

为了进一步探讨嘧啶5′核苷酸酶(P5′N)缺乏症的发病机制,我们利用P5'N的特异性底物尿苷一磷酸(UMP)作为配基,制备尿苷一磷酸-己二酰肼-琼脂糖4B(UMP-ADH-Sepharose 4B)亲和层析柱,结合硫酸铵分级分离和沉淀、离子层析及亲和层析等方法提纯人红细胞P5′N.将所得P5′N免疫家兔,获得兔抗人抗体.以兔抗人P5′N抗体为包被抗体,辣根过氧化物酶(HRP)-兔抗人P5′N抗体为显示抗体,经方阵法、抗原阻断试验及抗原替代试验后,建立定量测定人红细胞的P5'N双抗体夹心酶联免疫吸附实验.实验结果显示,所得兔抗人红细胞P5′N抗体效价为14,所建双抗体夹心ELISA法灵敏度为5 ng/ml,其阻断率大于95%,而取代率小于30%.同时,测定正常人红细胞P5′N含量为(71.77±10.98)ng/mg NHP.该法特异性强,敏感性高,可检测最低含量为5-20 ng/ml的P5'N含量,在临床上能适应大样本测定.