人骨髓间充质干细胞体外培养增殖过程及分化为心肌样细胞后的致瘤性实验

背景:人骨髓间充质干细胞在长期体外培养传代过程中,可突变为肿瘤干细胞,且移植后在体内能够形成恶性肿瘤,具有多向恶性分化特征,如畸胎瘤等.目的:探讨应崩白体血清培养的人骨髓间充质干细胞在体外增殖过程中及其诱导分化为心肌样细胞后的潜在致瘤性.设计、时间及地点:细胞学体外观察及体内植入实验,于2007-11/2008-04在河南省肿瘤医院干细胞实验室完成.材料:非恶性肿瘤的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者骨髓3 mL和外周静脉血50 mL.近交系BALB/C清洁级雌性小鼠12只,随机分为骨髓间充质干细胞组、心肌样细胞组、空白对照组,4只/组.方法;分离的人骨髓间充质干细胞从第2代开始,用自体血清培养并传至第9代.取生长良好的第6代细胞,加入10 μmol/L 5-氮杂-2′-脱氧胞苷向心肌样细胞定向诱导40 d.将经或未经诱导的骨髓间充质干细胞制成单细胞悬液,调整浓度至3.0×1010L-1,吸取0.2 mL分别接种于骨髓间充质干细胞组、心肌样细胞组小鼠皮下,空白对照组注射等量含胎牛血清的DMEM/F12培养液,40 d后留取活检组织.主要观察指标:流式细胞仪检测第1,3,6,9代细胞表面抗原CD34,CD44,CD45,HLA-DR的表达,测定细胞周期,并进行染色体核型分析,光镜下观察诱导后免疫组化结果.TRAP ELISA法检测端粒酶活性.Western blotting法分析c-myc和p16基因的表达.结果:第1,3,6,9代人骨髓间充质干细胞在自体血清体外培养过程中生长状态良好,数量充足,表面抗原标志CD44呈阳性,CD34,CD45及HLA-DR均呈阴性,80%以上细胞处于G0/G1期,正常二倍体分裂象＞90%,染色体核型正常,诱导后细胞Vimentin呈阳性表达,且表达心肌特异性标记Desmin,Troponin T.第3,6,9代人骨髓间充质干细胞及诱导后的心肌样细胞端粒酶活性分别呈弱阳性、阳性,但差异无显著性意义(P＞0.05),且c-myc和p16蛋白表达亦无明显差异.结论:人骨髓间充质干细胞在体外用自体血清培养可满足临床需要,数量充足,生长良好,无核型变异,定向诱导能分化为心肌样细胞.植入动物体内后无肿瘤发生,且端粒酶活性和c-myc,P16基因的表达无显著改变.

Tumorigenicity of human bone marrow mesenchymal stem cells during proliferation in vitro and following differentiation into cardiomyocytes