淋巴瘤Daudi细胞SHP-1甲基化及5-杂氮脱氧胞苷抑制性效应的研究

目的 研究甲基化抑制剂5-杂氮脱氧胞苷（5-aza-2’deoxycytidine，5-Aza-CdR）对Bur—kitt’s淋巴瘤细胞系Daudi细胞中的SHP-1抑癌基因的转录调控作用及对Daudi细胞生长增殖的生物学影响，寻找肿瘤治疗新靶点。方法 应用MTT法检测5-杂氮脱氧胞苷200．00，20．00，2．00，0．20μmol／L等不同剂量，作用24，48，72h对Daudi细胞存活率的影响。应用流式细胞术观察5-杂氮脱氧胞苷作用1，3，5d细胞周期及凋亡率的变化。用亚硫酸氢盐测序PCR（bisulfite sequencing PCR，BSP）、T-A克隆及DNA测序分析甲基化状态。RT-PCR、免疫组织化学法检测5-杂氮脱氧胞苷（2．00μmol／L）处理前和处理7dDaudi细胞SHP-1 mRNA及蛋白表达的变化，结果①经5-杂氮脱氧胞苷2．00μmol／L作用7d的Daudi细胞基因组DNA的胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶，未经5-杂氮脱氧胞苷作用的对照组Daudi细胞基因组DNA的胞嘧啶保持不变；②经5-杂氮脱氧胞苷作用7d，SHP-1 mRNA和蛋白均重新表达；③5-杂氮脱氧胞苷抑制Daudi细胞的增殖，在一定范围内与药物浓度及作用时间呈正相关，药物作用72h，剂量为200．00，20．00，2．00和0．20μmol／L时，瘤细胞增殖的抑制率分别为72．0％，65．1％，51．5％，28．8％和23．4％；④5-杂氮脱氧胞苷可使Dandi细胞凋亡率增加，且作用也呈时间依赖性，用药1，3，5d细胞凋亡率分别为2．3％，10．8％和17．1％；⑤5-杂氮脱氧胞苷对于细胞周期的影响，主要体现在S期和G1期，最显著的是5-杂氮脱氧胞苷2．00μmol／L作用24h后92．7％的细胞阻滞在S期；其次，在相同药物浓度下，G，期细胞数量随培养时间延长而增加，药物作用1，3，5d时，G1期细胞分别占细胞总数的1．2％，7．9％和21．5％。结论 DNA异常甲基化是导致Daudi细胞SHP-1基因缄默的重要原因；特异性甲基转移酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷能较好地逆转Daudi细胞DNA异常甲基化，并有效地激活因高甲基化所致SHP-1基因缄默的再转录，诱导该基因的表达，从而抑制肿瘤细胞生长。5-杂氮脱氧胞苷有望成为新型抗肿瘤药物，对Burkitts淋巴瘤的疗效可能更佳。

SHP-1 gene''''s methylation status of Daudi lymphoma cell and the demethylation effect of 5-aza-2''''-deoxycytidine