RNAi沉默Fas受体表达的腺病毒载体构建

目的：利用pEGFP6-1和pGenesil—1质粒构建针对小鼠Fas的2个短发卡状RNA（shorthairpinRNA，shRNA）串联表达的载体pEGFP6-1—siFasl＋siFas2，进一步通过BDAdeno—X系统构建腺病毒表达Fas—shRNA载体。方法：设计表达2个短发卡状RNA结构的互补DNA序列分别克隆至质粒载体pEGFP6-1和pGenesil—1中，酶切pEGFP6-1—siFasl大片段和酶切pGenesil—1—siFas2小片段，经T4DNAI,igase连接得到pEGFP6-1—siFasl＋siFas2重组质粒。双酶切重组质粒和pshuttle2穿梭质粒。经T4DNA连接酶连接得到pShuttle2-siFasl＋siFas2质粒。双酶切重组穿梭质粒，连接酶切产物和腺病毒转化感受态E.coil DH5a，PCR筛选鉴定阳性克隆，进一步线性化重组腺病毒pAdeno—siFasl＋siFas2质粒，经脂质体转染HEK293A细胞；收细胞进行裂解收病毒。结果：构建的重组质粒载体经酶切鉴定和测序分析，shRNA编码序列与设计的片段完全一致；重组腺病毒载体经酶切鉴定和PCR分析正确：经HEK293A细胞包装成功，能够表达绿色荧光蛋白。结论：成功构建Fas—shRNA腺病毒串联表达载体。

Construction of Recombinant Adenovirus Vector expressing Two Fas-Targeted shRNA