黑色浅灰链霉菌次级代谢产物杀螺活性及其作用机制初步研究

目的　评价放线菌黑色浅灰链霉菌（Streptomyces nigrogriseolus XD 2⁃7）代谢产物储存稳定性及其分离纯化产物实验室杀螺活性，并初步探讨其杀螺作用机制。方法　制备黑色浅灰链霉菌发酵上清液，将其于-20 ℃、4 ℃和28 ℃无光照条件下放置10 d后，测定其72 h浸杀灭螺效果；将发酵上清液置于100 ℃水浴中煮沸30 min后恢复至室温，测定其72 h浸杀灭螺效果；用浓盐酸和氢氧化钠调节发酵上清液pH值为4.0、6.0和9.0，室温下静置12 h，再调节发酵上清液pH至7.0，测定其72 h浸杀灭螺效果。用大孔树脂、硅胶和十八烷基硅烷键合硅胶依次对黑色浅灰链霉菌发酵产物进行4次分离纯化，将最终分离纯化产物配置成10.00、5.00、2.50、1.25 mg/L和0.63 mg/L浓度药液，测定其72 h浸杀灭螺效果。各实验设立空白对照组以脱氯水处理，阳性对照组以0.10 mg/L氯硝柳胺处理。采用高效液相色谱法测定经纯化代谢产物浸泡后钉螺软体组织中三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）含量。结果　黑色浅灰链霉菌发酵上清液在-20 ℃、4 ℃和28 ℃无光照条件下放置10 d后，原液及稀释10、50倍药液浸杀钉螺72 h，钉螺死亡率均为100.00%（30/30）；经100 ℃煮沸30 min后，原液及稀释10、50倍药液浸杀钉螺72 h，钉螺死亡率均为100.00%（30/30）。发酵上清液在pH值为4.0、6.0条件下存储12 h后浸杀钉螺72 h，钉螺死亡率均为100.00%（30/30）；在pH值为9.0条件下存储12 h后浸杀钉螺72 h，钉螺死亡率为33.33% (10/30，[χ2] = 30.000，P < 0.05)。发酵上清液最终分离纯化产物100.00%（30/30）杀死钉螺所需最低浓度为1.25 mg/L。以0.10 mg/L和1.00 mg/L浓度最终分离纯化产物处理钉螺后，钉螺软体组织中ATP水平较对照组显著降低（F = 7.274，P < 0.05），ADP水平与对照组差异无统计学意义（F = 2.485，P > 0.05）。结论　黑色浅灰链霉菌代谢产物中杀螺活性成分可在-20 ℃、4 ℃和28 ℃条件下稳定储存10 d，且耐热、耐酸而不耐碱，其杀螺机制可能是使钉螺能量代谢发生紊乱而死亡。