| 重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP的构建与鉴定*☆ |
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| 引用本文： | 王长昇,林建华,吴朝阳.重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP的构建与鉴定*☆[J].中国神经再生研究,2009,13(20):3947-3951. |
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| 作者姓名： | 王长昇 林建华 吴朝阳 |
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| 作者单位： | 福建医科大学附属第一医院骨科,福建医科大学附属第一医院骨科,福建医科大学附属第一医院骨科 |
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| 基金项目： | 国家高等学校博士学科专项科研基金(20060392003)* |
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| 摘 要： | 背景：基因治疗是目前脊髓损伤治疗的方向，目的基因和载体是基因治疗的关键。
目的：构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescence protein, EGFP)标志人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor，hBDNF)基因重组腺病毒载体。
设计、时间及地点：单一样本观察，实验于2007-09/2008-06在福建医科大学附属第一医院完成。
材料：感受态大肠杆菌DH-5α购自美国Stratagene公司；pDC316-hBDNF、载体质粒pDC316-mCMV-EGFP、腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre、腺病毒包装系统AdMax和包装细胞株293购自加拿大Mixcrobix-Biosystems公司。
方法：以pDC316-hBDNF为模板，聚合酶链反应扩增酶切获得hBDNF基因片段，连接到带有EGFP标记基因的载体质粒pDC316-mCMV-EGFP上，构建穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP。利用AdMax包装系统，穿梭质粒与骨架质粒pBHGlox_E1，3Cre共转染293包装细胞, 同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP，反复感染293细胞扩增病毒后，离子交换法纯化病毒，并测定病毒颗粒数及滴度。
主要观察指标：①hBDNF基因原始质粒聚合酶链反应鉴定。②穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP的构建及鉴定。③重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP的包装、扩增及纯化。④毒种目的基因的聚合酶链反应鉴定。⑤纯化病毒的滴度测定结果。
结果：经聚合酶链反应鉴定、限制性酶切分析及序列测定，证明已正确构建重组穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP和重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP；扩增纯化后，测得重组腺病毒颗粒数为2.4×1011VP / mL，A260/A280值约为2.0，滴度为0.8×1010 CCID50/ mL。
结论：已成功构建重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP，为hBDNF基因功能及基因治疗的进一步研究奠定实验基础。
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| 关 键 词： | 脑源性神经营养因子 腺病毒载体 增强型绿色荧光蛋白 基因重组 |
| 收稿时间： | 2/9/2009 12:00:00 AM |
| 修稿时间： | 4/3/2009 12:00:00 AM |
Construction and identification of recombinant adenovirus vector Ad5-hBDNF-EGFP |
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| Wang Chang-sheng,Lin Jian-hua and Wu Zhao-yang.Construction and identification of recombinant adenovirus vector Ad5-hBDNF-EGFP[J].Neural Regeneration Research,2009,13(20):3947-3951. |
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| Authors: | Wang Chang-sheng Lin Jian-hua and Wu Zhao-yang |
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| Institution: | Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Brain derived neurotrophic factor(BDNF) advenovirus vector Enhanced green fluorescent protein(EGFP) Genetic recombination |
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