人Leptin基因融合蛋白表达载体构建及对人成骨细胞的作用

背景：瘦素作为一种内分泌激素参与机体能量代谢的调节，近年来瘦素对骨代谢的调节作用也越来越被人们所重视。目的：克隆人Leptin基因，构建重组原核表达载体PEGX-5X-3/Leptin并在大肠杆菌中表达,观察Leptin融合蛋白对人成骨细胞的生长抑制作用。设计、时间及地点：单一样本观察，于2007-07/2008-05在苏州大学附属第一医院骨科实验室完成。材料：新鲜的脂肪组织取自苏州大学附一院（供者知情并同意）、大肠杆菌DH5α、人成骨细胞由苏州大学附属第一医院骨科实验室保种。方法：从人脂肪组织中提取RNA,采用反转录-聚合酶链式反应获得人Leptin全部序列，克隆入带有GST原核细胞表达载体PEGX-5X-3中，实现插入基因的融和表达，用SDS-PAGE和Western Blot对表达产物进行鉴定，提取并纯化GST-Leptin融合蛋白，以5，10，20，40 mg/L不同质量浓度与人成骨细胞共培养，同时设立相应浓度梯度的GST蛋白组，四甲基偶氮唑盐法测两组人成骨细胞的体外增殖情况。主要观察指标：①Leptin 基因的克隆与鉴定。②重组质粒的双酶切及聚合酶链反应鉴定。③融合蛋白的表达。④GST-Leptin融合蛋白的纯化。⑤GST-Leptin融合蛋白的鉴定。⑥GST-Leptin融合蛋白对人成骨细胞的生长影响。结果：反转录-聚合酶链反应扩增得到的特异性片段长度约为450 bp，以此构建的重组质粒PEGX-5X-3/Leptin，经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后显示5 kb和450 bp左右的两条片段，测序结果与Genbank中报道的完全一致，证明Leptin基因已成功地克隆到了原核表达载体PEGX-5X-3中。并在大肠杆菌中获得稳定的表达, 表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致，融合蛋白为Mr 45 000，GST蛋白为Mr 29 000，与GST蛋白组相比，20，40 mg/L的GST-Leptin融合蛋白可以明显促进细胞的生长 (P < 0.05)，且其促进作用有一定的浓度依赖性。结论：成功构建了PEGX-5X-3/Leptin重组原核表达载体，在E.coli BL21中表达GST-Leptin融合蛋白, 并以浓度依赖性促进人成骨细胞的生长。

Effect of Leptin fusion protein on growth of human osteoblast cells following constructing Leptin gene expression vector