成人骨髓间充质干细胞的分离、鉴定和生物学特性

背景：骨髓间充质干细胞具有自我复制的能力、多向分化和增殖的潜能，但骨髓中间充质干细胞的含量极少，因此体外纯化和扩增极其重要。目的：拟建立体外分离培养、纯化骨髓间充质干细胞的方法，观察其增殖及生长特性。设计、时间及地点：单一样本观察实验，于2006-05/2007-12在北京协和医院胸心外科实验室和桂林医学院附属医院中心实验室完成。材料：骨髓血来源于成人肋骨骨髓。方法：收集成人骨髓血，采用密度为1.077的Ficoll淋巴细胞分离液提取成体人骨髓单个核细胞，根据骨髓间充质干细胞易于贴壁的特性除去未贴壁细胞获取骨髓间充质干细胞。取第2~3代细胞在-80 ℃条件下冻存，24 h后复苏，观察活细胞数，按2×103/cm2种植扩增，扩增时保持细胞密度为2×103/cm2~8×103/cm2。主要观察指标：倒置显微镜和相差倒置显微镜观察细胞形态变化，流式细胞仪检测细胞抗原表达，采用细胞计数方法绘制原代培养和传代培养细胞生长曲线。结果：原代培养接种三四小时后细胞开始贴壁,24 h后贴壁细胞数量明显增多, 3 d后贴壁细胞为单个或几个细胞克隆，散在分布，大部分细胞呈纺锤形。7~9 d后集落迅速增多细胞融合,细胞数量约增加了10倍；10~12 d，细胞数量增加了约20倍，铺满了全层，细胞排列也有一定的方向性，呈旋涡样生长，旋涡中心细胞呈多层分布。骨髓间充质干细胞表达KDR、CD105，不表达CD34、CD45、CD11a、CD14、HLADR等。原代细胞培养曲线显示，第2~6天为生长潜伏期，第8~10天进入对数增长期，第12~14天进入个平台期；传代培养的潜伏期为24~48 h，对数增长期为4~6 d，细胞的增殖、生长逐渐缓慢，接种后8到9天进入平台期。结论：利用密度梯度离心和贴壁的方法获取的骨髓间充质干细胞具有大量增殖的能力，表达CD105、KDR，不表达HLA-DR、CD34、CD45、CD11a、CD14。

Isolation, identification and biological characteristics of adult bone marrow mesenchymal stem cells