血管内皮生长因子在原核细胞中的活性检测术

背景:目前血管内皮细胞生长因子制备困难,来源有限,限制了临床的应用.目的:用基因工程的方法在人肠杆菌中诱导表达人血管内皮生长因子165,分离纯化并检测其免疫学以及生物学活性.为后期构建携带血管内皮生长因子165蛋白的预成血管化组织工程骨提供了充足的蛋白来源.设计、时间及地点:开放性实验,单一样本观察,于2005-04/2007-01在陕两省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:携带目的基因血管内皮生长因子165的克降质粒PUC18-VEGF165由西安交通大学第二医院时志斌博士构建,PGEM-T easv 质粒购自美国Promerga公司,原核表达质粒购自德国Qiagen公司,DH5 α、M15、JM109菌株由陕西省疾病预防控制中心病毒研究室保存.方法:利用聚合酶链反应亚克隆的方法获得目的基因片段,构建表达质粒pQE30-VEGF165,在大肠杆菌JM109中用IPTG进行诱导表达并使用Ni2 -NTA进行蛋纯化.经过纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白.主要观察指标:①人血管内皮生长因子165基因的亚克隆结果.②重组表达载体pQE30-hVEGF165的鉴定结果.③人血管内皮生长因子165蛋白的诱导表达、纯化.④使用ELISA和Western blot技术检测人血管内皮生长因子165蛋白免疫学活性.⑤鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验检测其生物学活性.结果:重组表达质粒pQE30-VEGF165在大肠杆菌中成功地表达了相对分子质量为23 000的蛋白,其以不溶性的包涵体形式存在,占菌体蛋白的30%左右,经过分离和Ni柱纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白,浓度约为0.2g/L,ELISA和Western blot实验显示其具有良好的免疫学活性,鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验显示表达蛋白具有良好的生物学活性.结论:实验在原核细胞中稳定、高效表达了具有活性的血管内皮生长因子165蛋白,为后期预构血管化组织工程骨的构建提供了充足的蛋白来源.

Activity assay of vascular endothelial growth factor in prokaryocytes