| 基于报告基因系统的肝细胞核因子4α活性检测体系的建立 |
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| 作者姓名： | 孙冰洁 陈示洁 邓龙飞 丁晨虹 陈斐 罗成 谢渭芬 张新 |
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| 作者单位： | 1. 华东理工大学生物工程学院,上海,200237;2. 中国科学院上海药物研究所药物发现与设计中心,上海,201203;3. 第二军医大学长征医院消化内科,上海,200003;4. 华东理工大学生物工程学院,上海200237;第二军医大学长征医院消化内科,上海200003 |
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| 基金项目： | 上海市科学技术委员会生物医药领域科技支撑项目（15421907700）. |
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| 摘 要： | 目的 建立一个基于荧光素酶报告基因系统的肝细胞核因子4α(HNF4α)活性检测系统,筛选可调控HNF4α活性的小分子化合物.方法 采用亲和层析法纯化HNF4α蛋白,行蛋白热迁移实验检测相关DNA片段及小分子化合物与HNF4α蛋白的直接相互作用.分别构建含有3个拷贝和9个拷贝的Ninjurin 1(NINJ1)基因启动子区HNF4α反应元件的荧光素酶报告基因质粒pGL3-NINJ1-3p和pGL3-NINJ1-9p,转染肝癌细胞,采用荧光素酶报告基因法检测肝癌细胞内HNF4α转录活性的改变,qPCR检测小分子化合物木犀草素或阿尔维林处理后肝癌细胞中HNF4α及下游基因的表达情况,荧光素酶报告基因法检测小分子化合物处理后细胞内HNF4α转录活性的改变.结果 蛋白热迁移实验证实,NINJ1基因启动子区HNF4α的DNA结合片段可与HNF4α蛋白结合.在过表达HNF4α的肝癌细胞中,pGL3-NINJ1-3p和pGL3-NINJ1-9p均可检测到肝癌细胞中HNF4α活性的改变,且pGL3-NINJ1-9p较pGL3-NINJ1-3p的检测灵敏度更高(P＜0.01).木犀草素和阿尔维林与HNF4α蛋白存在直接相互作用,分别下调和上调HNF4α靶基因;pGL3-NINJ1-9p可检测到木犀草素和阿尔维林对HNF4α转录活性的影响.结论 利用报告基因载体pGL3-NINJ1-9p成功建立了HNF4α活性的检测系统,为筛选调控HNF4α活性的小分子化合物等提供了基础工具.
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| 关 键 词： | 肝细胞核因子4α Ninjurin 1 报告基因系统 小分子化合物 |
| 收稿时间： | 2017-05-20 |
| 修稿时间： | 2017-08-09 |
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