人髓核细胞诱导人尿源性干细胞向髓核样细胞分化作用的研究

【摘要】 目的：探讨人髓核细胞（NPCs）诱导对人尿源性干细胞（USCs）向髓核样细胞分化的作用。方法：手术时获取腰椎间盘突出症患者L4/5的髓核组织，并采用贴壁法体外分离培养NPCs；从健康成年人尿液中获取USCs并进行体外培养，通过倒置显微镜观察细胞形态，并采用成骨、成脂、成软骨三系诱导分化及蛋白免疫印迹技术（Western blot，WB）对所获取的USCs进行形态、分化潜能及细胞表面标志蛋白鉴定。使用Transwell小室将P3代NPCs与USCs培养以建立共培养体系，设实验组、对照组及NPCs组，实验组为NPCs与USCs共培养组，对照组为单独USCs培养，NPCs组为单独NPCs培养；培养14d后应用倒置显微镜观察细胞形态；应用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）及WB分别检测实验组USCs、对照组USCs与NPCs组NPCs中蛋白多糖（ACAN）、SOX-9（SRY-related high mobility groupbox gene 9）、Ⅱ型胶原（COL2）及缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的mRNA及蛋白的表达情况；免疫荧光染色观察3组 COL2A1及ACAN荧光表达。结果：培养的USCs成骨、成脂、成软骨三系分化实验结果均为阳性；USCs中干细胞阳性标志物CD29、CD44、CD73和CD90呈高表达，未检出干细胞阴性标志物CD34和CD45。培养14d后倒置显微镜下对照组及NPCs组细胞形态无变化，实验组USCs向髓核样细胞分化，形态变化明显。经共培养诱导14d后实验组及NPCs组中的ACAN、SOX-9、COL2A1及HIF-1α基因mRNA及蛋白表达均显著高于对照组（P<0.05），ACAN及COL2A1荧光强度明显高于对照组；实验组上述各种mRNA及蛋白表达与NPCs组比较均无统计学差异（P＞0.05），实验组荧光强度与NPCs组比较无明显差异。结论：在体外实验中，人NPCs可通过共培养的方式诱导人USCs分化为髓核样细胞，可为椎间盘组织工程研究提供NPCs来源。

Studies on the differentiation of urine-derived stem cells into nucleus pulposus cells induced by nucleus pulposus cells