NO信号通过I-kappaB磷酸化激活人肝细胞内源凝血因子Ⅷ重表达的调控作用

目的:建立一氧化氮（NO）前体化合物L-精氨酸激活人肝细胞L02内源凝血因子Ⅷ（FⅧ）重表达的分子细胞生物学模型，探讨NO信号激活L02中内源FⅧ重表达的调控通路及分子基础。方法:取对数生长期L02细胞随机分为对照组、加药组（L-精氨酸）、抑制剂组（L-NAME和L-精氨酸）和抑制剂对照组（L-NAME）,分别培养12、24、 36、48和60 h，采用流式细胞术检测作用48 h后L02中人FⅧ蛋白的表达， Griess法检测不同时间点L02细胞内NO水平， RT-PCR法检测L02中人FⅧ基因、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因、核转录因子（NF-κB1）基因和核因子κB（免疫球蛋白κ轻链基因增强子）抑制蛋白α亚基（I-κB alpha）基因的转录水平，Western blotting法检测L02中人磷酸化I-kappaB(磷酸化I-κB)表达水平。结果:流式细胞术检测,加L-精氨酸培养48 h后L02中出现人FⅧ蛋白的表达。Griess法检测，加药组L02在3、6和12 h内NO表达水平显著增加（P<0.05），随后又基本恢复到正常水平，正常组、抑制剂组和抑制剂对照组L02细胞内NO水平无变化；RT-PCR检测，加药组L02中人FⅧ mRNA转录；对照组、抑制剂组和抑制剂对照组均无人FⅧ mRNA的转录，加药组iNOS、NF-κB1和I-κB alpha转录水平均上升（P<0.05），对照组、抑制剂组和抑制剂对照组上述基因转录水平均无明显变化。Western blotting法检测，加入L-精氨酸后，磷酸化I-κB表达水平明显增加（P<0.05），其他组则无此变化。结论：L-精氨酸通过NO信号通路进而激活I-κB磷酸化，导致人FⅧ基因启动子上游调控相关的转录因子NF-κB1进入胞核从而激活人离体肝细胞L02中内源人FⅧ的表达。