| 直接从中国人胎肝染色体DNA中克隆粒细胞集落刺激因子（G－CSF）外显子及其在大肠杆菌中的高效表达 |
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| 引用本文： | 韩峰,吴淑华,薛水星,宋庆林,张燕军,魏佳,张智清,侯云德.直接从中国人胎肝染色体DNA中克隆粒细胞集落刺激因子（G－CSF）外显子及其在大肠杆菌中的高效表达[J].中华实验和临床病毒学杂志,1996(3). |
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| 作者姓名： | 韩峰 吴淑华 薛水星 宋庆林 张燕军 魏佳 张智清 侯云德 |
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| 作者单位： | 中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室 |
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| 摘 要： | 利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，直接从正常人胎肝染色体ＤＮＡ库中分离克隆了中国人粒细胞集落刺激因子（ｃ－ＣＳＦ）外显子，全长５３７ｂｐ，它包括除信号肽氨基酸外的所有编码区，为了使克隆的Ｇ－ＣＳＦ外显子在大肠杆菌中高效表达，对其５’端进行了修饰，去除第１个编码Ｔｈｒ的密码子，在不改变氨基酸的前提下，变换为ＡＴ丰富的密码子；并将某些密码子换成大肠杆菌喜用的密码子。对于每段目的ＤＮＡ所进行的２次独立的ＰＣＲ反应所获得的产物分别进行了核苷酸序列测定。结果完全一致，证明所克隆的Ｇ－ＣＳＦ外显子的序列是可靠的，与国外发表的Ｇ－ＣＳＦ外显子序列相比，未发现变异。将上述人Ｇ－ＣＳＦ外显于基因插入ｐＢＶ２２０表达载休，构建了ｐＢＶ２２０／Ｇ－ＣＳＦ质粒，将其转化入ＤＨ５ａ菌，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明其表达量约占菌体总蛋白量的２０％，用依赖性细胞系ＮＦＳ－６０进行测定，活性为５ｘ１０ｖＩＵ／Ｌ。
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| 关 键 词： | 粒细胞集落刺激因子，聚合酶链反应大肠杆菌，染色体 |
Directclonlngoftheexonscodlngforgranulocyte-colony-stimulatingfactor(G-CSF)anditshighlevelexpressioninEcoli |
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| HanFeng,WuShuhua,XueShuixingetalNationallaboratoryofmolecu-larVirologyandGeneticEngineering,InstituteofVirologyChineeseAcademyofPreventiveMedicine,Bei-jing.Directclonlngoftheexonscodlngforgranulocyte-colony-stimulatingfactor(G-CSF)anditshighlevelexpressioninEcoli[J].Chinese Journal of Experimental and Clinical Virology,1996(3). |
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| Authors: | HanFeng WuShuhua XueShuixingetalNationallaboratoryofmolecu-larVirologyandGeneticEngineering InstituteofVirologyChineeseAcademyofPreventiveMedicine Bei-jing |
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| Institution: | HanFeng,WuShuhua,XueShuixingetalNationallaboratoryofmolecu-larVirologyandGeneticEngineering,InstituteofVirologyChineeseAcademyofPreventiveMedicine,Bei-jing100052 |
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| Abstract: | DirectcloningofhumanG-CSFfromaChinesefetatliverbyPCRmethodwasreportedinthispaper.lso-latedG-CSFexonscontainsfullcodingsequenceof537bpformatureG-CSFgeneexceptsignalregion.PCRandsynthe-sizedoltigonucleotideprimerswereusedtomodifythe5'terminalcDNAsequenceofG-CSF.Aslongastheaminoacidsareunchanged,someGorChavebeenchangedtoAorT.ThehumanG-CSFischaracterizedbyDNAsaquencingtwicesepa-rately.SequencingoftheamplifiedfragmentswasbySangerdideoxymethod.ThesequenceofG-CSFisthesameasthatreportedbytheforeigncountry.TheG-CSFexonswasinsertedintothepBV220vector.SDS-PAGEanalysisrevealedthattheG-CSFacountedforabout20%* ofthetotalcellprotein.ThebiologicalactivitydetectedbyusingaG-CSFde-pendentcellline(NFS-60)isSx10.U/L. |
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| Keywords: | Granulocyte-colony-stimulatingfactorPolymerasechainreactionEscherichiacoliChromosomesDNA |
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