氧化应激对C2C12成肌细胞增殖与凋亡的影响

目的:利用过氧化氢作为外源性活性氧来源,探讨氧化应激对C2C12成肌细胞增殖与凋亡的影响。方法:实验于2005-10/2006-01在广东省组织构建与检测重点实验室完成。C2C12成肌细胞(美国ATCC,批号CRL-1722TM);过氧化氢(汕头市光华化学药厂,批号20050519)。①C2C12细胞置于含100mg/L青霉素,100mg/L链霉素和体积分数为0.1胎牛血清的DMEM-F12培养基中常规培养。②采用四甲基偶氮唑盐法测定过氧化氢对C2C12细胞增殖的影响。取体外培养的C2C12细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液,离心重悬,血细胞计数板进行细胞计数,细胞悬液密度为3.4×106L-1,接种至96孔板,200 μL/孔。实验共分5组:过氧化氢25,50,100,300 μmol/L浓度组、空白对照组,6个平行孔/组。各组在37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱内常规培养。待细胞融合率达80%且未出现细胞分化时,过氧化氢各浓度组分别向C2C12细胞中加入含对应浓度过氧化氢的无血清培养基,空白对照组则向C2C12细胞中加入单纯无血清培养基。各组细胞分别于过氧化氢处理0,6,12,24,36,48,60h后,每孔加入2g/L的四甲基偶氮唑盐液20μL,于酶联免疫仪570nm处检测各孔吸光度值。③过氧化氢对C2C12细胞凋亡的影响:采用Hoechst 33342/PI双染检测C2C12细胞凋亡。正常细胞核Hoechst着色为淡蓝色,形态呈圆形,内有较深的蓝色颗粒;中早期凋亡细胞核Hoechst着色呈亮蓝色,或核呈分叶,碎片状,边集;坏死或晚期凋亡的细胞核PI着红色,Hoechst因细胞膜破裂而不能着色。取体外培养的C2C12细胞,制备单细胞悬液过程同上,按1.8×107L-1密度接种至6孔板,5mL/孔。实验分组及干预措施同上,3个平行孔/组。处理36h后立即进行Hoechst33342/PI凋亡双染,荧光倒置显微镜下观察,各组随机取6个不同视野进行细胞计数,计数实验重复3次,取平均值作为细胞凋亡率。结果:①过氧化氢对C2C12细胞增殖的影响:细胞处理36h后与空白对照组比较,过氧化氢25 μmol/L浓度组平均吸光度值与之相近(0.207±0.014,0.199±0.023;t=0.677,P>0.05),即促进C2C12细胞增殖;过氧化氢50,100,300 μmol/L浓度组平均吸光度值均显著下降(0.182±0.027,0.149±0.009,0.052±0.012;t=1.990,8.251,20.004,P均<0.05),即抑制C2C12细胞增殖,且呈时效和量效关系。②过氧化氢对C2C12细胞凋亡的影响:细胞处理36h后,与空白对照组比较,过氧化氢25 μmol/L浓度组细胞凋亡率明显降低(9.09±0.85)%,(4.61±0.67)%;t=22.95,P<0.01];过氧化氢50,100,300 μmol/L浓度组细胞凋亡率则明显提高(33.50±5.74)%,(45.95±6.82)%,(76.47±4.66)%;t=4.35,4.68,18.02,P均<0.01],且呈时效和量效关系。结论:活性氧在C2C12成肌细胞增殖与凋亡过程中扮演重要角色,低浓度可促进C2C12细胞增殖,高浓度则能够抑制其增殖并促进凋亡,且呈时效和量效关系。提示氧化应激对成肌细胞的生长具有调节作用。

Effect of oxidative stress on myoblast C2C12 proliferation and apoptosis