单个巨噬细胞超氧阴离子水平的定量检测方法

目的：建立单个巨噬细胞超氧阴离子（O₂^-.）水平的定量检测方法,从而达到在单细胞内同时检测O₂^-.和细胞内游离钙离子浓度（Ca²⁺]_i）的目的。方法：分离小鼠腹腔巨噬细胞，用NBT还原法显示细胞产生O₂^-.的水平，以细胞加入NBT前与染色后的透光强度之比来定量表示该细胞产生O₂^-.的量；以荧光探针Fura-2/AM负载细胞检测单细胞内Ca²⁺]_i。结果：①分别用PMA、OZ刺激细胞并用NBT还原法染色后细胞内均有黑色沉淀，但前者分布均匀而后者所产生沉淀多偏于一侧，呈明显的局域性分布；②用NBT孵育10 min后，细胞透光强度没有明显变化（n=43, P>0.05），用NBT刺激细胞产生黑色沉淀后细胞透光强度明显降低（P<0.01, n=43）。③在不同的聚焦状态下，无细胞背景区的透光强度没有明显变化，而细胞区透光强度变化明显，但各个细胞透光强度的变化趋势是一致的；④PMA处理3批巨噬细胞并用NBT法染色得到3组R_OI值的分布情况提示用R_OI值定量是合理的但批间差异过大；⑤静息状态下的小鼠腹腔巨噬细胞Ca²⁺]_i与细胞受PMA刺激后的R_OI呈显著正相关（n=43, r=0.42, P<0.01）。结论：用NBT还原法染色前后细胞透光强度比值可以代表该细胞产生O₂^-.的量，进而我们可以在单细胞内同时检测O₂^-.和Ca²⁺]_i。

Quantitative analysis of supperoxide anion produced by macrophages on single cell level