| 人PTEN基因RNA干扰及其RESC救援慢病毒载体的构建与鉴定 |
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| 引用本文： | 王玉梅,盛光耀.人PTEN基因RNA干扰及其RESC救援慢病毒载体的构建与鉴定[J].郑州大学学报(医学版),2010,45(3). |
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| 作者姓名： | 王玉梅 盛光耀 |
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| 作者单位： | 1. 郑州大学第一附属医院儿科,郑州,450052;郑州大学第三附属医院儿内科郑州450052;美国圣路易斯华盛顿大学医学院血液系,密苏里州,63110-1093
2. 郑州大学第一附属医院儿科,郑州,450052 |
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| 摘 要： | 目的:构建人PTEN基因RNA干扰(RNAi)及其逃避RNAi策略结构(RESC)救援的慢病毒载体.方法:利用Invitrogen公司在线软件,针对已筛选确定的PTEN基因RNAi有效靶序列,设计并合成靶序列的oligoDNA,退火形成双链DNA,与经Xba I和XhoⅡ酶切后的pFLRu-GFP载体连接构建成pFLRu-U6-shPTEN慢病毒载体.在此基础上,引入外源设计的PTEN mRNA,与经EcoR I和BamH I酶切后的pFLRu-U6-shPTEN载体连接,从而产生在同一个载体内兼有人PTEN基因shRNA及其救援cDNA同时表达的RESC慢病毒载体pFLRu-U6-rrshPTEN.2者均转入到大肠杆菌XL10感受态细胞,制备质粒并用酶切及测序鉴定.分别用pFLRu-U6-shPTEN、pFLRu-U6-rrshPTEN与pCMV-dR8.2ΔR和pCMV-VSV-G质粒共转染293/包装细胞,包装产生2种慢病毒,收集病毒上清,系列稀释法检测病毒悬液的滴度.结果:氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆、酶切鉴定、U6前引物测序鉴定结果显示pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN均为阳性克隆,且2种慢病毒的滴度分别为6.6 × 105和5.6 × 105pfu/mL.结论:成功构建出人PTEN基因RNAi及其RESC慢病毒载体.有效地避免了由于脱靶效应所引起的假阳性结果对实验的干扰,为研究PTEN基因功能提供了稳定的转染细胞载体.
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| 关 键 词： | PTEN基因 慢病毒载体 RNA干扰 逃避RNA干扰策略结构 脱靶效应 |
Construction and identification knockdown and RESC concurrent rescue of RNAi lentiviral vector on human PTEN gene |
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| WANG Yumei
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SHENG Guangyao.Construction and identification knockdown and RESC concurrent rescue of RNAi lentiviral vector on human PTEN gene[J].Journal of Zhengzhou University: Med Sci,2010,45(3). |
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| Authors: | WANG Yumei SHENG Guangyao |
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