多重实时定量PCR同时检测人全血中大肠杆菌与白念珠菌基因方法的建立

目的 建立多重实时定量PCR (MRQ-PCR)同时快速检测血中大肠杆菌与白念珠菌DNA的方法,以评估肠屏障损伤可能导致的移位微生物的种类和程度并提供针对性用药的建议.方法 选择大肠杆菌β-右旋半乳糖苷酶基因作为检测大肠杆菌的靶基因设计引物和探针,选择白念珠菌ITS2基因设计引物和探针.采用QIAamp(R) DNA Blood Mini Kit试剂盒提取大肠杆菌与白念珠菌基因组DNA;建立25 μl TaqMan探针MRQ-PCR反应体系;对18份模拟血标本及10份外科发热患者临床标本进行MRQ-PCR检测.结果 引物和探针特异性好,大肠杆菌与白念珠菌标准曲线相关系数分别在0.994～0.999和0.994～0.998,扩增效率分别为0.894～1.022和0.905 ～1.028.标准样品检测限分别为大肠杆菌13.9拷贝/μl和白念珠菌0.8 cfu/μl,两种菌的检测灵敏度分别为100％和99.69％,特异度分别为100％和94.73％,标准品中大肠杆菌与白念珠菌特异基因平均回收率分别为(101.89±5.69)％和(103.74±4.64)％,两种菌基因检测的批内变异系数分别为(13.14±10.27)％和(19.18±8.54)％,批间变异系数分别为(14.35 ±9.34)％和(18.31 ±10.25)％.全血标本中大肠杆菌与白念珠菌特异基因的检出限分别为12 455.2拷贝/ml和800.3 cfu/ml,平均回收率分别为(111.60±11.06)％和(99.96 ±6.16)％,两种菌基因检测的批内变异系数分别为(11.02±5.65)％和(8.14±7.29)％,平均批间变异系数分别为(12.88±7.59)％和(18.62±9.14)％.结论 多重实时定量PCR可以同时快速、灵敏、特异地定量检测人全血标本中大肠杆菌与白念珠菌基因,准确度高、重复性好、节省血标本用量及检测成本、总检测时间缩短,在临床全血标本的真菌与细菌快速鉴别检测、抗微生物药物的针对性应用及疗效评估、肠屏障损伤后果及疗效的评估中有较实用的推广前景.

Multiplex real-time quantitative polymerase chain reaction for simultaneous detection of Escherichia coli and Candida albicans genes in human whole blood