TRAIL胸外段基因克隆及其表达与纯化 |
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引用本文: | 周海胜,田方,等.TRAIL胸外段基因克隆及其表达与纯化[J].中国免疫学杂志,2002,18(7):451-453,456. |
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作者姓名: | 周海胜 田方 |
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摘 要: | 目的;克隆TNF相关的诱导凋亡配体胞膜外段基因(the extracellular region of the human TRAIL cDNA,TPAILex),构建表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达有生物学活性的TRAIL蛋白胞膜外段。方法:抗CD3McAb刺激正常人外周血淋巴细胞,用RT-PCR、巢式-PCR方法从活化的淋巴细胞中获得人TRAIL基因及其胞膜外段cDNA,并克隆到pGEM-T Easy载体中,DNA测序鉴定,将TRAIL的胞膜外段基因插入表达载体pGEX-2T,构建重组表达质粒pGEX/TRAILex,用IPTG诱导表达TRAIL蛋白的胞膜外段,GST-Agarose 4B层析柱纯化GST-TRAILex融合蛋白,Western-blot鉴定纯化产物。结果:抗CD3 McAb能诱导正常人外周血核细胞TRAIL的高表达,成功地克隆了TRAIL胞膜外段基因,构建了重组表达载体pGEX/TRAILex,IPTG诱导后得到高效表达的TRAIL蛋白胞膜外段,经12%SDS-PAGE分析,可观察到一分子量和理论值相符(约54kD)的诱导表达。Kodak软件分析表达GST-TRAIL胞膜外段融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的28%,进一步分析证实TRAIL蛋白的胞膜外段主要以可溶性的形式表达,用GST-Agarose 4B层析柱纯化超声破菌后的上清,每升细菌培养液可得到9.8mg纯度的95%以上的GST-Tex。Western-blot结果证实54kD的表达带可与鼠抗TRAIL McAb起特异性反应。结论:成功地克隆了人TRAIL基因,并应用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人TRAIL蛋白的胞膜外段,为进一步研究TRAIL的功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础。
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关 键 词: | TNF相关的凋亡诱导配体 基因克隆 基因表达 蛋白质纯化 肿瘤生物治疗 |
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