NF?κB p65调控IRF?8基因启动子活性及其启动子结合元件的初步鉴定

目的：探讨大鼠核因子?κB（nuclear factor?κB，NF?κB）p65亚基在细胞内过表达和其活性变化对干扰素调节因子?8（interferon regulatory factor?8，IRF?8）基因启动的影响，并初步筛查IRF?8启动子上可能的p65结合元件。方法：采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术扩增大鼠p65基因蛋白编码区（complete sequence coding，CDS）序列，将其插入到空载pIRES2?EGFP质粒中，构建大鼠野生型（wild type，WT）p65过表达质粒（pIRES2?p65 WT）。在此基础上，将p65第535位丝氨酸（serine，S）突变为天冬氨酸（aspartic，D）或丙氨酸（alanine，A），分别构建p65持续活化突变型质粒（pIRES2?p65 S535D）和p65显性负性突变型质粒（pIRES2?p65 S535A）。之后应用生物信息学软件预测IRF?8基因启动子区p65的结合元件，并据此构建IRF?8启动子全长（full?length，FL）和3个截短的荧光素酶报告质粒，即pGL3?IRF?8?FL（-1 892 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?1（-1 360 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?2（-752 ~ +174 nt）和pGL3?IRF?8?3（-68 ~ +174 nt）。将上述质粒行不同组合共转染人胚肾293T（human embryonic kidney 293T，HEK?293T）细胞，Western blot和荧光素酶实验分别检查p65的表达和IRF?8的启动子活性，并分析IRF?8启动子区可能的p65结合元件。结果：菌液PCR及测序证实上述质粒构建成功。分别将pIRES2?p65 WT、pIRES2?p65 S535D、pIRES2?p65 S535A和pGL3?IRF?8?FL共转染HEK?293T，发现过表达pIRES2?p65 WT或pIRES2?p65 S535D均可明显增加IRF?8启动子活性，且以pIRES2?p65 S535D更为显著；而过表达pIRES2?p65 S535A后，IRF?8启动子活性无明显变化。将pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1~3和pIRES2?p65 S535D共转染HEK?293T后发现，pGL3?IRF?8?3的启动子活性显著低于pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1和pGL3?IRF?8?2，提示大鼠IRF?8启动子-752~68 nt区域可能存在p65结合元件。结论：在HEK?293T细胞内过表达野生型或持续活化突变型p65可显著促进IRF?8基因的启动，且p65与IRF?8启动子的结合元件可能位于-752~-68 nt部位。