NF?κB p65调控IRF?8基因启动子活性及其启动子结合元件的初步鉴定 |
| |
引用本文: | 王文博,钱宝梅,罗 灿,彭明玉,张 婧,赵 聃,王迎伟,邱 文,季明德.NF?κB p65调控IRF?8基因启动子活性及其启动子结合元件的初步鉴定[J].南京医科大学学报,2020(5):638-644. |
| |
作者姓名: | 王文博 钱宝梅 罗 灿 彭明玉 张 婧 赵 聃 王迎伟 邱 文 季明德 |
| |
作者单位: | 南京医科大学免疫学系,江苏 南京 211166;江苏省中医院检验科,江苏 南京 210006 |
| |
基金项目: | 国家自然科学基金(31470853,81603358,31770934,81971468) |
| |
摘 要: | 目的:探讨大鼠核因子?κB(nuclear factor?κB,NF?κB)p65亚基在细胞内过表达和其活性变化对干扰素调节因子?8(interferon regulatory factor?8,IRF?8)基因启动的影响,并初步筛查IRF?8启动子上可能的p65结合元件。方法:采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增大鼠p65基因蛋白编码区(complete sequence coding,CDS)序列,将其插入到空载pIRES2?EGFP质粒中,构建大鼠野生型(wild type,WT)p65过表达质粒(pIRES2?p65 WT)。在此基础上,将p65第535位丝氨酸(serine,S)突变为天冬氨酸(aspartic,D)或丙氨酸(alanine,A),分别构建p65持续活化突变型质粒(pIRES2?p65 S535D)和p65显性负性突变型质粒(pIRES2?p65 S535A)。之后应用生物信息学软件预测IRF?8基因启动子区p65的结合元件,并据此构建IRF?8启动子全长(full?length,FL)和3个截短的荧光素酶报告质粒,即pGL3?IRF?8?FL(-1 892 ~ +174 nt)、pGL3?IRF?8?1(-1 360 ~ +174 nt)、pGL3?IRF?8?2(-752 ~ +174 nt)和pGL3?IRF?8?3(-68 ~ +174 nt)。将上述质粒行不同组合共转染人胚肾293T(human embryonic kidney 293T,HEK?293T)细胞,Western blot和荧光素酶实验分别检查p65的表达和IRF?8的启动子活性,并分析IRF?8启动子区可能的p65结合元件。结果:菌液PCR及测序证实上述质粒构建成功。分别将pIRES2?p65 WT、pIRES2?p65 S535D、pIRES2?p65 S535A和pGL3?IRF?8?FL共转染HEK?293T,发现过表达pIRES2?p65 WT或pIRES2?p65 S535D均可明显增加IRF?8启动子活性,且以pIRES2?p65 S535D更为显著;而过表达pIRES2?p65 S535A后,IRF?8启动子活性无明显变化。将pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1~3和pIRES2?p65 S535D共转染HEK?293T后发现,pGL3?IRF?8?3的启动子活性显著低于pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1和pGL3?IRF?8?2,提示大鼠IRF?8启动子-752~68 nt区域可能存在p65结合元件。结论:在HEK?293T细胞内过表达野生型或持续活化突变型p65可显著促进IRF?8基因的启动,且p65与IRF?8启动子的结合元件可能位于-752~-68 nt部位。
|
关 键 词: | 核因子?κB p65(NF?κB p65) 干扰素调节因子?8(IRF?8) 启动子 结合元件 |
收稿时间: | 2019/11/17 0:00:00 |
|
| 点击此处可从《南京医科大学学报》浏览原始摘要信息 |
| 点击此处可从《南京医科大学学报》下载免费的PDF全文 |