复合诱导液诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞分化

目的:目前对脂肪基质细胞向神经元样细胞分化基本采用人工合成的化学诱导剂的方法进行诱导,其中部分组合试剂费用昂贵,不适合进行大规模基础和临床实验。因此以复合诱导液作替代,观察其能否在体外诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞方向分化。方法:实验于2004-10/2005-06在华北煤炭医学院中学实验室完成。①实验材料:腹部皮下的脂肪组织来源于30例自愿捐献者,年龄20～35岁,通过外科手术获得。复合诱导液的组成:alpha-MEM BHA(200μmol/L) KCl(5mmol/L) 丙戊酸钠(2μmol/L) IBMX(0.5mmol/L) 氢化可的松(1μmol/L) 胰岛素(5mg/L) 乙醇(0.5%) 青霉素(100U/mL) 链霉素(100mg/L)。②实验方法:离体的脂肪组织消化、离心、过滤,进行人脂肪基质细胞的原代培养。按8×103/cm2接种,消化传代。取第3代人脂肪基质细胞,接种到孔中预先放置无菌盖玻片的24孔培养板,细胞生长达50%～60%融合时,去除培养液,换为复合诱导液进行诱导;空白对照组培养液为DMEM/F12培养基。③实验评估:自加入诱导剂后在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况和形态变化,应用免疫细胞化学方法检测神经前体细胞的特异性标志神经巢蛋白、神经细胞的特异性标志神经元特异性烯醇化酶及微管联合蛋白2、神经胶质细胞的特异性标志胶质纤维酸性蛋白的表达。结果:①体外培养过程人脂肪基质细胞的形态学观察:刚分离接种的细胞呈圆形,悬浮状态。接种24h内细胞大多已贴壁,呈梭形、圆形或多角形,有粗大突起,核居中,1～2个核仁。48h后贴壁细胞开始分裂增殖,多呈梭形。1周后细胞融合成单层,排列出现方向性,但有少量圆形及卵圆形细胞混杂生长。②复合诱导液诱导脂肪基质细胞向神经元样细胞分化的形态学观察:人脂肪基质细胞胞体回缩,呈圆形或锥形,胞体周围具有较强的光晕,胞体有突起伸展,具有典型的神经细胞样形态。空白对照组形态无变化。③免疫细胞化学检测神经元样细胞的特异性标志的表达:诱导5h后,人脂肪基质细胞神经巢蛋白阳性表达率为(21.8±2.6)%,神经元特异性烯醇化酶为(36.8±3.3)%,微管联合蛋白2为(92.0±10.5)%,胶质纤维酸性蛋白为(96.0±5.6)%。空白对照组细胞以上各指标表达均呈阴性。结论:复合诱导液可替代费用昂贵的人工合成的化学诱导剂,在体外成功诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞分化。

Differentiation of human adipose-derived adult stromal cells into neuron-like cells induced by differentiation cocktail