Klenow大片段的聚合酶及核酸酶活性在重组质粒构建中的巧用

目的 探讨应用大肠杆菌Klenow大片段同时补平及切平DNA 3'凹端或3'凸端的可行性。方法 以构建乙型肝水（乙肝）病毒S基因的真核表达载体为例，用Kpn I及Xhol I消解含乙肝病毒前S/S基因的质粒，切除质粒中的前S区基因序列。通过Klenow大片段的核酸外切酶的活性切平质粒Kpn I切口的3'凸端，再利用其聚合酶活性补平Xhol I的3'凹端。处理后的质粒经连接酶作用而自身环化后，转化并筛选阳性克隆。结果 重组质粒获得了限制性内切酶分析的证实；对重组质粒的序列测定表明，Kpn I及Xhol I酶切端经Klenow大片段切(补)平并重新连接后其接续口端序列与预期一致。结论 对质粒作内部改建中，质粒两端分别为3'凸端及3'凹端时，可以同时利用Klenow大片段的两种酶活性将DNA末端修饰为平端，以便于使质粒自身环化。