不同冻存复苏条件影响K562细胞的生物学特性

目的:观察不同冻存复苏条件对白血病K562细胞株生物学特性的影响,并优化培养条件与方法。方法:实验于2006-02/2006-04在吉林医药学院临床检验实验室进行。①将欲冷冻保存的细胞调整到良好的生长状态,即对数生长期。将细胞分成密度相同的4个组。离心收集后分别加入冻存保护液二甲基亚砜,其终浓度依次为5%、10%、15%、20%分装于冻存管。冻存15d后,每组取出1支复苏并接种于细胞培养板培养。培养12h后吸取少量实验细胞,加入等体积的0.1%台盼蓝染液,5min后在血球计数板上计数,被染成深蓝色的细胞为死细胞;染色很淡、边缘光滑且胞体透明的细胞为活细胞。每个标本计数500个细胞,计数2次取平均值,计算细胞的复苏率。②选择冻存条件和冻存细胞密度相同的2支冻存细胞,采用2种不同的方法进行复苏。第1组:立即将冻存管置37℃水浴中,待融化后1000r/min离心5min,吸去上清液,加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养基,混匀后接种于细胞培养板继续培养。第2组:将冻存细胞于40℃水浴中迅速溶解后转入37℃水浴箱,融化后离心、加培养基等操作同第1组。复苏细胞培养12h后采用台盼蓝染色计算细胞的平均存活率。③用无血清RPMI-1640培养基制备3×104/mL的K562细胞悬液接种于细胞培养板中,每孔1mL,然后分别加入5%、10%、12%、15%、20%的灭活小牛血清,每种血清浓度设置4个试验孔并于培养12,24,36,48,60,72,84,96h后每种浓度各取1孔计数细胞量,绘制细胞生长曲线。结果:①5%、15%、20%二甲基亚砜组冻存K562细胞复苏率分别与10%二甲基亚砜组比较,差异显著(86.70%,82.03%,63.09%,88.13%,P均<0.01)。②传统37℃水浴方法复苏后的细胞平均存活率,与40℃溶解后37℃恒温方法比较,差异非常显著[(69.13±1.01)%,(87.50±2.24)%,P<0.01]。③在5%血清含量培养基中,K562细胞基本不生长,且有逐渐死亡的趋势;在10%血清含量培养基中K562细胞生长趋势明显,但生长速度相对较慢;在12%、15%、20%血清含量培养基中K562细胞生长迅速,但3种血清浓度之间细胞生长趋势无明显差异。结论:以10%二甲基亚砜作为K562细胞冻存保护剂并采用改良复苏方法可使细胞保持最佳生物学特性,12%血清为K562细胞常规培养的最适浓度。

Effects of different cryopreserved and resuscitative conditions on biological characteristics of K562 cell