抑癌基因TCF21重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：利用大肠杆菌BJ5183细菌内同源重组法构建重组腺病毒pAd-TCF21载体。方法设计TCF21cDNA 扩增引物，从真核表达载体pCMV-SPORT6.1-TCF21中扩增TCF21的DNA序列，与腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV进行连接，构成穿梭质粒pAdTrack-TCF21；然后再用经PmeI酶线性化的pAdTrack-TCF21转化含pAdeasy-1的超感受态AdBJ5183，采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAd-TCF21；筛选同源重组质粒阳性克隆，提取pAd-TCF21质粒经PacI酶切鉴定和PCR鉴定。结果线性化的pAdTrack-TCF21转化含pAdeasy-1的超感受态AdBJ5183，12~20h后获得了40%阳性重组质粒克隆，经酶切获得＞23kb的大片段和3.0 kb的特征性片段，PCR反应扩增出了540bp的片段，证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因TCF21。结论细菌内同源重组法成功构建了含TCF21基因的重组腺病毒质粒，为下一步腺病毒介导的TCF21转染A549细胞的研究打下基础。