构建T载体快速克隆丙型肝炎病毒5′端非编码区扩增产物

为探讨自行构建Ｔ载体的简便方法，克隆丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５′端非编码区（５′ＮＣＲ）扩增产物，并为制备ＨＣＶ检测探针作准备。以ＳｍａⅠ消化质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋），酶切产物纯化后在仅含有脱氧腺苷酸的聚合酶链反应（ＰＣＲ）缓冲液中７０℃作用２小时，构建成Ｔ载体。根据ＰＣＲ扩增产物３′端存在一个非模板依赖的脱氧腺苷酸原理，将扩增产物直接克隆入Ｔ载体。同时以ＳｍａⅠ消化的质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）与ＰＣＲ产物平端连接作为对照。限制性酶切长度多肽性分析，ＰＣＲ及ＤＮＡ序列测定等均证实克隆构建成功。ＡＴ克隆的连接效率约为平端连接的４２倍。以上结果表明，构建Ｔ载体经济、简便。ＡＴ克隆快速、有效。所构建的克隆可用作ＰＣＲ实验对照模板或制备探针。