差速贴壁技术与常规培养方法对窦房结细胞培养中提高梭形细胞纯化率的影响

目的:比较差速贴壁技术与常规培养方法对窦房结梭形细胞比例,旨在建立一套可靠的窦房结梭形细胞取材分离、纯化培养技术。方法:实验于2004-05在解放军第四军医大学心血管外科实验室完成。选用出生24h内的新西兰乳兔15只。对新西兰乳兔的窦房结组织进行原代细胞培养,将培养容器置于37℃、体积分数0.05CO2孵箱中培养(常规方法)。将培养容器置于37℃、体积分数0.05CO2孵箱中培养90min后,采用单细胞悬液中夹杂一部分心房肌细胞和成纤维细胞,成纤维细胞与心肌细胞相比,其贴壁过程快,大部分成纤维细胞能在短时间内(约30～60min)完成贴壁过程;而心肌细胞在短时间内不附着或附着不稳定,轻微震荡就可以浮起,利用这一点得到纯化心肌细胞的差速贴壁分离技术,并采用5-溴脱氧尿核苷抑制除心肌细胞外其他生长比较快的细胞(如成纤维细胞的生长),从而造成更有利于心肌细胞生长的环境。比较两种方法处理后各形态窦房结细胞的比例。结果:①在窦房结的培养中,起搏细胞、过渡细胞、和心房肌细胞都存在,起搏细胞的比例是评价培养方法的重要指标。差速贴壁技术结合5-溴脱氧尿核苷处理的纯化培养中窦房结梭形细胞比例明显高于常规方法犤(65±4)%,(45±3)%,P<001犦。②差速贴壁结合5-溴脱氧尿核苷处理的纯化培养的窦房结细胞梭形细胞电生理特征符合窦房结起搏细胞的特点,即动作电位有舒张期自动去极化。记录的10个梭形细胞的动作电位中平均最大舒张电位为(-50.9±4.8)mV,动作电位幅度为(62.9±5.0)mV。结论:①梭形细胞动作电位的特性与分离的窦房结单细胞的记录结果相似,证实了梭形细胞就是窦房结起搏细胞。②常规原代培养过程中,成纤维细胞生长速度快,而心肌细胞生长偏慢,成纤维细胞的数量很快会超过心肌细胞,使培养细胞中混杂有大量的成纤维细胞,从而影响心肌细胞培养模型的可靠性。③5-溴脱氧尿核苷可显著抑制培养心肌细胞中的成纤维细胞生长,且对心肌细胞无毒性与抑制作用,可使培养细胞中心肌细胞所占比例提高明显。因此用差速贴壁结合5-溴脱氧尿核苷处理的纯化培养较常规培养可更明显提高窦房结梭形细胞的比例,是一种可靠的窦房结细胞培养技术。

Influenceof differential velocity adherent technique and primary culture in improving the purified rate of fusiform cells in the culture of sinoatrial node cells