转基因番茄Zeneca B,Da,F实时荧光定量PCR检测体系的建立

摘要：目的构建转基因番茄Zeneca B,Da,F品系的质粒标准分子及其实时荧光定量PCR（qPCR）检测体系。方法基于反
向遗传学原理构建分别含有番茄内标准基因apx检测序列（ERG-apx），转基因番茄B,Da,F品系pg基因的基因特异性序列
（GS-pg）及其构建特异性序列（CS-16S、CS-16A）的番茄内参质粒标准分子pEasy-T3-APX，转基因番茄B,Da,F品系的构
建特异性质粒标准分子pEasy -T3- 16A、pEasy-T3-16S；以Beacon Designer 7.5设计用于定性PCR和qPCR检测的引物对
和Taqman探针；基于质粒标准分子建立了定性PCR和qPCR检测体系，对方法的特异性、敏感性、重复性、检测下限等指
标进行评估；使用PicoGreen 试剂盒对质粒标准分子进行定量，以质粒pEasy-T3- APX 为背景DNA 定量混有
pEasy-T3-16A或pEasy-T3-16S制备成含量为1%和0.1% (w/w)的两组核酸标准物质，进行所构建qPCR检测体系的定量
性能评价。结果锚定qPCR检测靶序列：ERG-apx 108 bp, GS-pg 108 bp，CS-16S 109 bp、CS-16A 102 bp；酶切鉴定所构
建的质粒标准分子均可得到预期大小的插入子片段；所建立的实时荧光定量PCR（qPCR）检测体系，重复性的相对标准差
（RSD）0.2%~1.5%，检测下限25 copies，标准曲线方程线性关系R2值在0.994~0.998，效率在93.3%~102.4%。经换算系数
Cf换算，对PicoGreen定量的样品进行验证，其实测值与真值的偏差是-9.7%~17.3%。结论成功构建了转基因番茄Zeneca
B,Da,F品系的质粒标准分子及其qPCR检测体系，为转基因番茄Zeneca B,Da,F品系转基因成分的监测建立了可行的
可供使用的定性与定量检测体系。

Construction of quantitative real-time PCR detection system of transgenic tomato line Zeneca B,Da,F

To construct the plasmid reference molecules for detection of transgenic tomato line Zeneca B,Da,F using quantitative real-time PCR(qPCR).Methods Three plasmid reference molecules pEasy-T3-APX,pEasy-T3-16A and pEasy-T3-16S were cloned based on reverse genetics,which contain the target fragments of tomato endogenous reference gene apx(ERG-apx),gene-specific sequence of pg(GS-pg) and construct-specific sequence of vectors pJR16S/pJR16A(CS-16S/CS-16A) of Zeneca B,Da,F,respectively.Primers and Taqman probes wer...