大鼠胰腺间质细胞体外培养过程及其形态学特征

目的：对胰腺间质细胞进行原代及传代培养，观察其形态学的变化。以探索一种简单稳定的获取及培养胰腺间质细胞的方法。方法：用机械剪切加胰蛋白酶消化的方法制备SD大鼠胰腺单细胞悬液，取新生SD大鼠1只麻醉断髓处死，体积分数0．75的乙醇浸泡消毒，无菌条件下取出胰腺组织，去除红细胞，剪切，加入胰蛋白酶消化，消化终止后细胞筛过滤，收集滤过的细胞悬液离心，弃上清液，重复1次。收集获得的单个胰腺间质细胞。接种丁含体积分数0．1的胎牛血清、0．05g/L的砸胺培南的DMEM／F—12（1：1）培养基，培养48h后换液，弃上清及悬浮细胞，继续培养48h后，换用含1&;#215;10^-5mol／L阿糖胞苷的完全培养基培养24h，再换正常培养基继续培养，在培养细胞达到80％～90％的细胞汇合时，按1：3进行传代培养。测定细胞生长曲线及贴壁率，原代细胞及传代细胞用双硫腙染色，鉴定有无胰腺β细胞。结果：①原代细胞及传代细胞形态学观察：原代培养换液前，显微镜下可见细胞大小不等，悬浮，有较多细胞碎片。48h首次全量换液后，悬浮细胞减少，经3次换液可基本去除。加用阿糖胞苷培养24h，大量细胞相继死亡。至第10—14天，培养细胞明显增加，基本铺满瓶底，以星形、梭形为主，细胞呈放射状或漩涡状生长，部分区域呈灶状。传至第5代细胞出现老化。②细胞生长曲线：细胞从传代后第2天，数量即开始增加，第4天增加幅度最大，至第6天细胞数茸最大，以后数量略有下降。传代培养对数增殖期为2—4d，对数增殖期结束后，第6天细胞生长缓慢，进入平台期。③细胞的贴壁率：传代细胞培养2h已有部分细胞贴壁；培养4h贴壁细胞接近50％；培养10h贴壁达79％；培养12h细胞全部贴壁，而且部分细胞开始分裂增殖，细胞形态与原代细胞基本相似。④胰腺β细胞的化学鉴定：对胰腺组织分离所得单个细胞、原代培养细胞及传代培养细胞分别用双硫腙染色，培养前细胞染色，可见少量腥红色细胞，随着培养时间延长腥红色细胞逐渐减少，在原代培养10～14d，腥红色细胞消失，传代培养细胞染色未见腥红色细胞。结论：细胞培养12h全部贴壁，传代培养对数增殖期为2—4d，第6天细胞进入平台期。原代培养胰腺间质细胞形态多样，主要呈梭形，少数呈三角形或星形，贴壁爬行生长，第1周增殖较慢，随后增殖加速，细胞团块多见，偶可见大的圆形细胞生长，核大，胞浆内颗粒多。传代培养，细胞能迅速贴壁生长，细胞形态逐渐均一，主要为梭形、三角形细胞，呈集落样生长，双硫腙染色阴性；但细胞培养至第5代，胞浆颗粒增多，细胞增殖减慢，大部分细胞逐渐老化死亡。

Process of in vitro culturing rat pancreatic mesenchymal cells and their morphological characteristics