金黄色葡萄球菌 eap 基因的克隆与表达 |
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引用本文: | 卢杰,卢珍.金黄色葡萄球菌 eap 基因的克隆与表达[J].中国医药生物技术,2008,3(3):210-213. |
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作者姓名: | 卢杰 卢珍 |
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作者单位: | 1.大庆医学高等专科学校基础医学部生物化学教研室;2.解放军二六一医院妇产科 |
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摘 要: | 目的 构建携带 eap 基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组 EAP 融合蛋白。 方法 PCR 法扩增金黄色葡萄球菌基因组 DNA,回收、 纯化的扩增产物与 pMD18-T 载体相连接得重组质粒 pMD18-T-EAP,转化 E.coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;未酶切组作为对照组重组质粒 pMD18-T-EAP 和 pET28a(+)表达载体分别用 Nde I 和 Xho I 限制性内切酶双酶切、连接,转化 E.coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;空载体作为对照组。用不同浓度(终浓度 1、2、4、8 mmol/L)和不同诱导时间(1、2、3、4、5、6 h)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对阳性重组菌进行表达优化,分别取 E.coli上清液和沉淀做电泳分析。应用 MagneHisTM 蛋白纯化系统纯化重组 EAP 融合蛋白,并通过薄层扫描测定蛋白质的浓度。 结果 所获 eap 基因与 GeneBank 的基因序列同源性 > 99%;氨基酸同源性达 100%。重组质粒经 IPTG 诱导,阳性重组菌转化子均有表达;当吸光度(A )值等于 0.6 ~ 0.8 时,相对分子质量约 70 000 处出现目的蛋白条带。破碎的重组菌 pET28a-EAP上清液中目的蛋白条带较清楚,沉淀中几乎看不到。终浓度 1 mmol/L 为最佳蛋白表达工作浓度。IPTG 诱导 1 h 重组 EAP 融合蛋白有一定量的表达,随着时间的延长,表达量增加不明显,3 h 时的表达量达最高,之后,蛋白表达量变化不明显。表达的重组 EAP 融合蛋白含量占全菌体蛋白的 29.6%。 结论 成功地克隆和表达了金黄色葡萄球菌重组 EAP 融合蛋白,为进一步研究以 EAP 蛋白作为免疫原预防和治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病奠定基础。
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关 键 词: | 葡萄球菌 金黄色 克隆 分子 基因表达 胞外黏着蛋白 |
收稿时间: | 2008-01-30 |
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