近交系小鼠体细胞核移植胚胎的构建和鉴定

背景：体细胞核移植技术己成功用于多种动物的克隆，但其过程中核移植技术的成功率较低。 目的：通过对卵母细胞不同去核方法的对比分析，观察其对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响，并利用微卫星DNA技术进行核移植囊胚鉴定，幸刀步建立小鼠体细胞核移植技术平台。 设计、时间及地点：以卵母细胞为观察对象的对比实验，于2005—09/2007-10在广西医科大学医学科学实验中心及动物实验中心完成。材料：选用C57BL／6小鼠卵母细胞为受体、BALB／c小鼠卵丘细胞为供体。取600枚受体卵母细胞，根据去核方法不同分为3组。每组200枚。 方法：①盲吸法：吸出卵母细胞第1极体及其附近的适量胞质。②蔗糖辅助去核法：以含蔗糖显微操作液预处理卵母细胞，吸出可见的细胞核等遗传物质。③荧光染色去核法：Hoechest33342预处理卵母细胞，在紫外光下用去除遗传物质。乙醇联合二甲氨基嘌呤进行重构胚激活，激活后卵裂培养基液滴中培养。根据Mouse Genome Database设计小鼠微卫星DNA多态聚合酶链反应引物，提取近交系小鼠体细胞核移植囊胚、供体BALB／c小鼠、受体C57BL／6小鼠及昆明小鼠的基因组DNA，使用巢式聚合酶链反应扩增选定的序列。最终扩增出4个微卫星位点DNA片段，即D3Mit28，D11Mit258，D12Mit136及D14Mit50。主要观察指标：比较3种去核方法的去核率、卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数差异。对巢式聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。 结果：①盲吸去孩法的去核率、处理重构胚的体外发育能力均低于荧光染色去核法和蔗糖辅助去核法（P〈0.05）。②荧光染包去核法的去核率高于蔗糖辅助去核法（P〈0.05），两组的囊胚率及囊胚细胞数差异均无显著性意义（P〉0.05）。③巢式聚合酶链反应可扩增微量基因组DNA。通过微卫星DNA序列的扩增，证明核移植囊胚的微卫星DNA与供体细胞完全相同，而与受体细胞或者对照细胞无亲缘关系。 结论：荧光染色去核法和蔗糖辅助去核法适用于小鼠核移植，可支持小鼠体细胞核移植胚胎的早期发育。微卫星分析证实体细胞核移植囊胚为供体BALB/c小鼠的克隆，微卫星DNA分析可用于小鼠体细胞核移植囊胚的鉴定。

Reconstruction and identification of inbred strain mouse somatic cell nuclear transplanted embryos