大肠杆菌β-半乳糖苷酶ED和EA的克隆、表达及活性测定

目的：制备大肠杆菌β-半乳糖苷酶（β- galactosidae）酶供体(ED)和酶受体(EA)片段，获得具有全酶活性的β-半乳糖苷酶。方法：以pSV-β- galactosidase control vector为模板设计引物，用PCR方法获得ED和EA片段DNA序列，插入克隆载体pGEM-T-easy中，获得重组质粒，经酶切、PCR及测序鉴定正确后，将酶切目的片段分别插入原核表达载体pET20b+，并转化大肠杆菌BL21，通过IPTG诱导表达出ED、EA融合蛋白，以亲和层析纯化蛋白，通过ED与EA蛋白形成β-半乳糖苷酶、全酶活性试验来判断ED、EA的功能。结果：获得与pSV-β- galactosidase control vector一致的ED、EA碱基序列，构建了重组表达质粒pET20b-ED及pET20b-EA，并分别转化入大肠杆菌DE3，以IPTG诱导行SDS-PAGE电泳，在相对分子质量为14 000及116 000处分别可见ED蛋白和EA蛋白条带，应用镍凝胶亲和层析纯化获得目的蛋白。结论：成功地制备了ED、EA蛋白，形成全酶活性的β-半乳糖苷酶。