p62基因缺失对人脂肪间充质干细胞成脂的促进作用

目的：探讨p62基因缺失对人脂肪间充质干细胞（hADSCs）自噬活性的影响，阐明脂肪分化的分子机制。方法：应用Ⅰ型胶原酶消化法从人大腿皮下脂肪抽吸液中分离培养hADSCs，使用80 μmol·L^-1油酸（OA）联合地塞米松和胰岛素对hADSCs进行成脂诱导；将hADSCs分为对照组和p62基因缺失组，p62基因缺失组hADSCs转染p62 shRNA慢病毒载体，对照组hADSCs转染hADSCs空载体。采用CCK-8实验绘制2组细胞的生长曲线并观察细胞增殖活性变化；应用尼罗红染色观察脂滴的形成（尼罗红脂滴染色阳性细胞数），Western blotting法检测成脂标志转录因子C/EBPα和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型/微管相关蛋白1轻链3Ⅰ型（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）蛋白表达，磺酰成二胺（MDC）染色检测2组细胞成脂中的自噬活性（MDC染色阳性细胞数），采用LC3与Mitotracker Red荧光共定位检测2组细胞的线粒体自噬活性，使用环孢菌素A（CsA）分别抑制2组细胞线粒体自噬活性并进行成脂诱导，光镜下计数含脂滴细胞数。结果：分离培养的细胞呈多角形或梭形，传代后细胞呈漩涡状排列；OA诱导hADSCs成脂后，细胞内有大量脂滴形成。CCK-8实验，在培养6 d后p62基因缺失组细胞增殖活性较对照组明显降低（P<0.01）。2组细胞诱导成脂后，与对照组比较，p62基因缺失组hADSCs中尼罗红脂滴染色阳性细胞数增多，C/EBPα蛋白表达水平升高（P<0.01），MDC染色阳性细胞数明显升高（P<0.05），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平升高（P<0.01），细胞中LC3的点状化和颗粒化增多，与线粒体的共定位现象增加。使用CsA抑制线粒体自噬后，光镜下观察，p62基因缺失组含脂滴细胞数降低到与对照组接近的水平。结论：p62基因缺失可通过增强总自噬及线粒体自噬促进hADSCs的成脂。

Promotion effect of p62 gene deletion on adipogenesis of human adipose-derived stromal cells