结合RNAi技术的三重表达HCV DNA疫苗的构建及其在HepG2细胞中的表达 |
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作者姓名: | 杨化强 曹以诚 杜正平 卓敏 黄镜贤 李新建 石川 张珍武 |
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作者单位: | 华南理工大学生物科学与工程学院,广东,广州,510641 |
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基金项目: | 国家自然科学基金重大研究计划资助项目(90412015);教育部中国网格计划生物信息网格平台子项目(B1-137040130);广州市科技局RNAi专项资助项目(G0282060030) |
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摘 要: | 目的:构建多表位抗原基因、hIL-12、小分子干扰RNA(siRNA)共质粒表达的新型复合丙型肝炎DNA疫苗并在HepG2细胞中表达.方法:设计并合成复合多表位丙肝抗原基因,将其与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合克隆进真核表达载体pVAX1的多克隆位点中;利用pVAX1载体上卡那霉素抗性基因与复制起始位点之间的非功能区域,将带CMV启动子的hIL-12表达单元克隆进该区域的BspH Ⅰ位点中;同时将8组针对丙肝的siRNA表达单元分别克隆进载体复制起始位点下游非功能区域的Mlu Ⅰ位点上,构建三重表达的HCV DNA疫苗pVAX1-HC-EGFP-hIL12-siRNA.以该重组质粒转染人肝癌细胞系HepG2,通过EGFP的荧光标记观察多表位抗原的表达;以靶向EGFP的siRNA做为对照验证siRNA的表达及其干扰效果;ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达.结果:经酶切鉴定和测序证实三重表达的复合HCV DNA疫苗构建成功.在转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达;靶向EGFP的siRNA亦能显著抑制EGFP的表达;转染后48 h hIL-12的检出量为1 289 ng/L细胞上清,72 h检出量为1 712 ng/L细胞上清.结论:成功地构建多表位抗原基因、hIL-12和siRNA共质粒表达的丙肝DNA疫苗,并能在真核细胞中有效表达抗原基因、hIL-12并介导RNA干扰效应.为进一步研究该DNA疫苗抗HCV的免疫治疗和基因治疗效果打下基础.
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关 键 词: | 丙型肝炎 DNA疫苗 多表位抗原 siRNA hIL-12 结合 RNAi 三重 有效表达 疫苗 治疗效果 基因 免疫治疗 研究 干扰效应 真核细胞 转染细胞 抗原表达 绿色荧光 检测 测序 酶切鉴定 结果 上清 培养细胞 |
文章编号: | 1007-8738(2008)01-0082-05 |
收稿时间: | 2007-02-08 |
修稿时间: | 2007-04-16 |
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