氧浓度对人髓核间充质干细胞生物学特性的影响

目的 :分离培养髓核来源的间充质干细胞(MSCs),比较不同氧浓度下细胞的生物学特性,探讨氧浓度对椎间盘退变机制的影响。方法:用胶原酶消化法从手术摘除的4个腰椎间盘(椎间盘Pfirrmann分级为Ⅰ级或Ⅱ级)髓核组织中分离MSCs,体外培养、传代,观察记录细胞形态。取P3代细胞,用流式细胞仪对分离得到的细胞表面抗原CD90、CD73、CD105、CD44和CD31、CD34、CD45的表达情况进行检测;用成骨、成脂、成软骨培养液诱导培养细胞,分别在21d、28d、21d时用茜素红、油红O、甲苯胺蓝对细胞进行染色,观察其成骨、成脂、成软骨能力。在三气培养箱的低氧条件(2%O_2、5%CO_2、37℃)和常规细胞培养箱的常氧条件(20%O_2、5%CO_2、37℃)下分别培养P3代细胞。通过细胞计数统计培养1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d时的细胞数量,比较不同氧浓度下细胞的生长曲线;使用Architect c8000自动生化检测仪检测培养1d、2d、3d、4d、5d时培养基的pH值和渗透压。实时荧光定量(q RT-PCR)检测不同氧浓度培养下细胞的干性基因POU家族类别5同位序列1(POU5F1,OCT4)、NANOG同位序列(NANOG)、性别决定区Y盒2(SOX2)及扩增基因细胞周期蛋白D1(Cyclin D1,CCND1)、MYC(c-Myc)、低氧诱导基因低氧诱导因子2α(HIF2α,EPAS1)、能量基因三磷酸腺苷合成酶(ATP5A1)、线粒体相关基因细胞色素c氧化酶Ⅳ亚基1型同工酶(COX4I1)、线粒体转录因子A(TFAM)、线粒体编码细胞色素c氧化酶Ⅰ(MT-CO1)、MT-CO_2的mRNA表达情况。结果:分离培养的细胞呈典型的单层贴壁生长,纺锤样;P3代细胞免疫表型鉴定显示MSCs表面分子标记高表达CD90(80.4%)、CD73(99.9%)、CD105(99.8%)、CD44(95.9%),低表达CD31(5.3%)、CD34(4.4%)、CD45(6.8%);茜素红、油红O染色、甲苯胺蓝染色证实细胞可向骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化。根据国际干细胞治疗协会(ISCT)有关MSCs的判定标准,分离培养的细胞为髓核MSCs(NPMSCs)。低氧环境下培养的细胞形态更小,更接近原始MSCs,细胞增殖更快,低氧时倍增期为31.22±1.98h,常氧时倍增期为39.56±2.02h,差异有统计学意义(P0.05)。不同氧浓度各时间点培养基的pH值、渗透压差异无统计学意义(P0.05),且皆在适合细胞生存的范围。低氧培养下POU5F1(OCT4)、NANOG、SOX2、CCND1、MYC(c-Myc)、EPAS1、ATP5A1较常氧培养时显著性升高(P0.05);COX4I1、TFAM、MT-CO1、MT-CO_2较常氧培养时显著性降低(P0.05)。结论 :低氧条件下培养有利于人NPMSCs的细胞形态、干性基因、增殖能力等生物学活性的维持。

Biological characteristics of human nucleus pulposus mesenchymal stem cell under different oxygen concentrations