比较不同来源人成骨细胞的体外培养模式及其生物学特性

目的:建立不同来源人成骨细胞的体外培养模式,比较颅骨、骨膜、骨髓来源的成骨细胞的生物学特性。方法:实验于2002-9/2004-3在东南大学修复重建外科研究所完成。①从人4个月龄胚胎骨膜、颅骨及骨髓组织中分离培养出骨膜来源的成骨细胞,颅骨来源的成骨细胞和骨髓基质干细胞并对骨髓基质干细胞进行成骨诱导培养。②体外动态观察细胞的生长情况和形态学变化,用第2～4代细胞进行细胞鉴定和生物学特性的比较。③通过相差显微镜,Giemsa染色及透射电镜观察比较细胞的形态和超微结构,通过生长曲线,比较细胞的增殖能力。经碱性磷酸酶染色和钙结节染色比较细胞的成骨活性,并经X射线能量散射分析鉴定钙结节的元素成分。结果:培养的颅骨、骨膜来源的成骨细胞和在诱导培养下的骨髓基质干细胞具有成骨细胞的形态、生长及功能特点。骨膜、颅骨来源的成骨细胞以功能态为主,骨髓基质干细胞以增殖态为主。①体外增殖结果:3种细胞的增殖能力依次为:骨髓基质干细胞、颅骨来源成骨细胞、骨膜来源的成骨细胞。②形态学观察:第3代后3种细胞在形态上无明显的差别,在超微结构上骨膜来源的成骨细胞和颅骨来源的成骨细胞为高分化细胞,骨髓基质干细胞为低分化细胞。③成骨功能表达:骨膜来源成骨细胞第15天,颅骨来源成骨细胞第17天光镜下可见褐色的钙化结节形成,骨髓基质干细胞在诱导液条件下培养24d时可见褐色结节;矿化结节X射线能量散射分析,其Ga/P元素含量比值,骨膜来源成骨细胞为2.16±0.17,颅骨来源成骨细胞为2.39±0.21,骨髓基质干细胞为2.57±0.15;骨膜来源成骨细胞的碱性磷酸酶染色阳性率为95.2%,颅骨来源成骨细胞为89.6%,骨髓基质干细胞(诱导后)为69.0%。骨髓基质干细胞(未诱导)碱性磷酸酶染色阴性。3种不同来源的人成骨细胞成骨能力依次为:骨膜来源的成骨细胞、颅骨来源成骨细胞、骨髓基质干细胞。结论:采用改良的酶消化法,培养骨、骨膜来源的成骨细胞,通过加以改进的密度梯度离心法,培养骨髓基质干细胞,可得到均一性好,活性强的3种不同来源的人成骨细胞。

Comparison of in vitro culture modes and biological characteristics of human osteoblasts from different sources