体外培养及其诱导分化人胚胰腺巢蛋白和神经元素3阳性细胞的实验

目的：观察从人胚胎胰腺体外分离培养的巢蛋白和神经元素3阳性细胞，分析其基因表达及诱导分化能力，探讨为胰腺组织工程移植提供种子细胞的可能性。方法：实验于2002—01／2004—05在北京大学干细胞中心完成。实验采用标本为北京市海淀妇产医院产科药物引产的人胚胎，引产药物为米索。使用的胚胎经孕妇同意，并签署同意书。选取18例胎龄为12～24周的人胚胰腺，用Ⅴ型胶原酶消化获得贴壁生长的人胚胰腺细胞，观察其原代培养、传代培养、增殖能力及体外诱导分化能力；胰腺干细胞标志巢蛋白和神经元素3阳性细胞及胰岛素表达应用免疫荧光染色及反转录聚合酶链反应检测；细胞总蛋白中胰岛素含量应用化学发光法检测。结果：18例胎龄为12～24周的人胚胰腺全部纳入实验。①人胚胎胰腺组织体外培养和诱导分化：人胚胎胰腺组织消化后可获得胰岛样结构，能贴壁生长，传代20代以上，然后进入凋亡期。汇合的细胞加入诱导分化培养基，24h后即可见大部分细胞聚集成团；周围散在贴壁细胞突起细长，立体感增强。随着诱导时间的延长，细胞增殖缓慢，个别细胞脱落、死亡。细胞团易于脱落漂浮，继而死亡。但仍有部分细胞及细胞团贴壁生长。②巢蛋白、胰岛素、胰高血糖素、广谱角蛋白及角蛋白19含量测定：无论是第2代还是第10代细胞中均无胰岛素、胰高血糖素CK-Pan和CK-19染色阳性的细胞。第2代细胞中，巢蛋白阳性细胞约占总细胞数的20％，个别细胞核神经元素3阳性，多数细胞为两者均阴性。第10代细胞中95％以上为巢蛋白强阳性细胞，约90％细胞神经元素3阳性且阳性部位同时存在于细胞核和细胞质中，并与巢蛋白共表达。但第18代细胞，荧光染色神经元素3染色转阴性（反转录聚合酶链反应可检测到少量mRNA的表达），而巢蛋白阳性无明显变化。③诱导前后巢蛋白和神经元素3阳性细胞及胰岛素表达：诱导前有巢蛋白、胰十二指肠同源盒基因-1、神经元素3的表达，无胰岛素表达。诱导后出现胰岛素表达，胰十二指肠同源盒基因-1表达增高，巢蛋白和神经元素3表达下降。④胰岛素含量测定结果：诱导分化后，巢蛋白和神经元素3阳性细胞的总蛋白质中含有胰岛素量为2．10IU／g总蛋白，作为阳性对照的人胚胎胰腺组织总蛋白中的含量为2．70IU/g总蛋白，而未诱导的细胞的总蛋白质中未检测到胰岛素。结论：从人胚胎胰腺可以体外分离获得巢蛋白和神经元素3阳性人胚胎胰腺干细胞，为未分化细胞，能在体外大量扩增，可长期培养。总蛋白中有胰岛素表达，有分化为胰岛素阳性细胞的潜能，有望为胰腺组织工程移植提供足够的种子细胞。

An experimental study on isolation, culture and inductive differentiation of the Nestin and Neurogenin 3 positive cells from human fetal pancreas in vitro