华支睾吸虫成虫RPEF基因的克隆和表达

目的　构建华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子 (RPEF)基因重组质粒 ,分析其编码序列 ,并进行大肠杆菌原核重组表达和免疫鉴定。方法　根据RPEF基因已知序列设计一对引物 ,用常规PCR技术从华支睾吸虫质粒文库模板中扩增RPEF基因片段 ;将目的基因PCR产物和空质粒 pGEX 4T 1同时用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切 ,纯化回收后建立连接反应并转化大肠杆菌BL2 1。将构建的重组质粒pGEX 4T 1 RPEF双酶切、PCR、测序鉴定正确后在BL2 1中诱导表达 ,SDS PAGE电泳和Western blot方法鉴定其原核表达效果。结果　成功构建出RPEF基因原核重组质粒 pGEX 4T 1 RPEF。SDS PAGE分析显示RPEF基因在大肠杆菌BL2 1系统中得以高效表达 ,其融合蛋白分子量大约 4 5kD ,与理论值相符。Western blot的结果显示此RPEF融合蛋白可被山羊GST单抗所识别 ,融合蛋白具有GST免疫反应性。结论　筛选到华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子 (RPEF)基因 ,并成功构建原核表达载体及在E .coliBL2 1系统中高效表达。