构建人突变型p27基因重组腺病毒在结肠癌细胞SW480中的表达

背景：大肠癌的发病率呈明显上升趋势。以往的治疗主要为手术治疗、化学治疗和放射治疗。目前基因疗法已应用于大肠癌治疗的临床实践中。目的：构建复制缺陷型重组hp27mt基因腺病毒并检测其在SW480细胞中的表达，探讨腺病毒载体用于基因治疗的可行性及突变p27的抗肿瘤特性。设计：非随机对照实验。单位：郧阳医学院附属人民医院消化内科，郧阳医学院临床医学研究所，武汉大学中南医院消化内科。材料：实验于2002-01／2003-09在郧阳医学院临床医学研究所完成。AgeⅠ，NheⅠ，KpnⅠ，PacⅠ和PmeⅠ等限制性内切酶；Tag酶，T4DNA连接酶；Western blot检测试剂盒；鼠抗人p27kip1多抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG单抗；pORF9-hp27mt质粒，腺病毒骨架质粒pAdeasy-1,穿梭质粒pShuttle-CMV，LacZ重组腺病毒，脂质体，结肠癌细胞株SW480。方法：①hp27mt自载体pORF9-hp27mt中切出，经2次亚克隆，插入到穿梭质粒pShuttle-CMV中，形成转移质粒pShuttle-CMV-hp27mt；然后再用PmeI线性化的pShuttle-CMV-hp27mt转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的超感受态BJ5183，使其在细菌内发生同源重组。重组质粒鉴定正确后经PacI酶切，转入Ad293细胞，包装成重组腺病毒Ad-hp27mt。采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒进行鉴定，用紫外分光光度计进行滴度测定。②用重组p27mt的腺病毒Ad-p27mt感染大肠癌细胞SW480，应用Western Blot检测p27蛋白的表达。主要观察指标：①腺病毒在Ad293细胞中的包装过程。②Ad-p27mt的聚合酶链反应检测Ad-p27mt转染大肠癌细胞后的p27mt的表达。结果：①用含pShuttle-CMV-hp27mt转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183后，可获得约30％的阳性重组质粒。②聚合酶链反应检测表明重组腺病毒DNA中含有目的基因。重组腺病毒滴度为7．95&;#215;10^15pfu／L。③转染大肠癌细胞后，p27在SW480中获得了高表达，而未转染细胞和LacZ重组腺病毒转染的细胞中仅有低表达。结论：复制缺陷重组腺病毒能有效介导突变p27基因在肿瘤细胞内表达，为观察突变p27基因对大肠癌的治疗作用提供了有效的基因转移载体。