人端粒酶逆转录酶慢病毒载体的构建及人肝细胞的初步筛选

目的： 构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）慢病毒表达载体，将其转染人肝细胞L02并且通过杀稻瘟筛选出阳性克隆细胞。方法：以PBABE-puro-hTERT质粒为模板PCR法获取目的基因attB1- hTERT-attB2，通过BP反应克隆至pDONR221；采用LR重组酶将pDONR221-hTERT和pLenti6/V5-DEST进行重组反应，形成pLenti6/V5-DEST- hTERT。将重组载体pLenti6/V5-DEST- hTERT与包装质粒充分混合，利用脂质体共转染293FT细胞，获得重组慢病毒颗粒。将其感染人肝细胞L02，通过杀稻瘟筛选获得阳性克隆。结果：测序发现入门载体pDONR221包含的目的基因hTERT 1547位点存在点突变(原碱基A变成G），通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST- hTERT成功构建。重组慢病毒滴度为1×108 TU/L，获得20株稳定抗性的单克隆细胞。结论：成功构建人端粒酶逆转录酶的慢病毒表达载体，获得稳定抗性的单克隆肝细胞，为进一步建立永生化肝细胞系奠定了基础。