CRISPR/Cas9介导下UPS系统-E3泛素连接酶ITCH基因敲除细胞株的初步构建

目的：构建CRISPR/Cas9介导下泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome system,UPS）-E3泛素连接酶（atrophin 1interacting protein 4,ITCH）基因敲除细胞株。方法：在人ITCH基因的PAS结构域内设计3个sgRNA，构建3个分别同时表达ITCH-sgRNA、Cas9和eGFP的三合一质粒。经测序序列正确的重组质粒用lipofectamine 3000转染HeLa细胞，24h后荧光倒置显微镜观察转染情况。结果：3个ITCHsgRNA寡核苷酸单链成功退火成为双链，经测序发现，设计的3个ITCH-sgRNA全部重组到了CRISPR/Cas9载体上。荧光检测发现在同时表达ITCH-sgRNA、Cas9和eGFP的三合一质粒转染的HeLa细胞内有绿色荧光。结论：成功构建了同时表达ITCH-sgRNA、Cas9和eGFP的三合一质粒，并将三合一重组质粒成功转入细胞中，为实现在HeLa细胞中完全敲除ITCH基因，从而为构建ITCH基因敲除稳定株奠定了基础。