p53缺失和突变对人肺癌细胞系恶性表型影响的比较

目的 比较研究外源正义和反义p53对所转染细胞系恶性表型的影响。方法 构建正义和反义p53C—DNA真核细胞表达载体pEGFP—p53(RS)，pEGFP—p53(AS)，载体有绿荧光蛋白基因监测基因转染和表达。经酶切图证明p53正向或反向联结。Liipofectin介导转染801D细胞(801D细胞有p53缺失和突变，蛋白表达阳性)，G418筛选，建立单克隆细胞系。PCR检测外源p53和neo基因。荧光显微镜检查转染细胞绿荧光蛋白表达。免疫组化染色证明突变蛋白表达。比较了pEGFP—p53(AS)和pEGFP—p53(RS)集落形成试验，裸鼠移植试验。FCM分析细胞周期。结果 酶切图证明pEGFP—p53(RS)和pEGFP—p53(AS)的p53c—DNA(RS)分别正向和反向联结质粒pEGFP。Lipofectin介导转染细胞801D细胞，G418筛选，获耐受集落，建立单细胞克隆转染细胞系pEGFP—p53(RS)—801D，pEGFP—p53(AS)801D和pEGFP—801D。PCR检测外源p53和neo基因存在于细胞，细胞可见绿色荧光，证明外源基因存在并稳定表达。免疫组化检测pEGFP—p53(AS)—801D，突变蛋白呈阴性，母系为阳性，显示反义p53封闭突变蛋白表达。pEGFP—p53(RS)—801D和pEGFP—p53(AS)801D细胞集落形成率和裸鼠移植成瘤率均降低，pEGFP—p53(RS)-801D更低。FCM分析细胞周期延滞。结论 有p53缺失和突变的人肺癌细胞系801D体内外恶性增殖明显，在同一细胞背景下，p53缺失比p53突变对恶性增殖起更重要作用。外源野生型p53在肿瘤细胞中可重建抑癌功能，外源反义p53可封闭突变蛋白表达，阻止细胞停留于G1期。